Difference between revisions of "Team:Ionis Paris/05 06 16"

(Created page with "{{IONIS_HEADER}} <html> <!-- ====Google font==== --> <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Merriweather:400,700,700italic,400italic,300italic...")
 
Line 54: Line 54:
 
                                           <h3>Competence:</h3>
 
                                           <h3>Competence:</h3>
 
                                
 
                                
−
<ol><li><p>1. In a 1.5 mL Eppendorf tube, adding in the respected order (bigger volume first and enzyme last) :</p>
+
                        <ol> <li><p>Inoculation of 3 mL O/N culture in 100 mL LB in 500 mL erlenmeyer.</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>2. Short Spin Centrifugation</p>
+
                               <li><p>Incubation at 250 rpm at 37°C until the DO 0,6 —> DO = 0.615</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>3. Incubation 1h at 37°C  </p>
+
                               <li><p>Cells were transferred to 3 sterile ice-cold 50 mL Falcon tubes. 20 mL in each falcon tube.</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>4. Store at 4°C before gel electrophoresis and purification </p>
+
                               <li><p>Incubate on ice for 30 min. Do not allow cells to warm up over 4°C.</p>
−
                              </li></ol>
+
−
                           
+
−
                                          <h3>Electrophoresis for digested BBC5:</h3>
+
−
                                <p> 1% Agarose gel:</p>
+
−
                             
+
−
                              <li><p>1. Put 1 g of agarose low melting point + 100 mL of TAE 1X in a bottle of 500 mL.</p>
+
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>2. Mix and heat it 2min 30s in the microwaves. Wait the cooling of the bottle until it is tepid.</p>
+
                               <li><p>Spin cells at 4000 rpm for 10 min at 4°C.</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>3. Add 3 µL of Gel Red 10,000X (0.3X final).</p>
+
                               <li><p>Discard supernatant and try to drain all remaining media.</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>4. Flow the gel and place the combs.</p>
+
                               <li><p>Gently resuspend on 10 mL cold 0.1M CaCl2</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>5. Wait until it is solidified. Remove slowly the combs.</p>
+
                               <li><p>Incubate on ice 20 min</p>
−
                              </li>
+
−
                                <p>Drop-off:</p>
+
−
                              <li><p>1. Short Speed centrifugation of samples.</p>
+
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>2. Addition of 4 µL of Purple loading dye 6X in the 20 µL of sample.</p>
+
                               <li><p>Centrifuge 10 min at 4,000 rpm at 4°C</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                               <li><p>3. Drop-off 10 µL of Purple ladder and 25 µL of sample.</p>
+
                               <li><p>Discard supernatant and gently resuspend on 5 mL cold 0.1M CaCl2/25% Glycerol</p>
 
                               </li>
 
                               </li>
−
                                <p> Plan:</p>
+
                               <li><p>Transfer in 1.5 mL eppendorf (100 µL/tube)</p>
−
                               <li><p>4. Run at 90 V.</p>
+
 
                               </li>
 
                               </li>
−
 
+
                               <li><p>Store at -80°C</p>
−
                              <h3>Gel purification for C5:</h3>
+
−
                              <p>QIAquick Gel purification kit (Qiagen, 28704), according to the protocol given by the supplier (available on https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=f4ba2d24-8218-452c-ad6f-1b6f43194425&lang=en)</p>
+
−
                               <li><p>1. Excise the DNA fragment from the agarose gel. Gel slice Weigh = 0.235 g</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>2. Add 3 volumes Buffer QG (705 µL) to 1 volume of gel.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>3. Incubate at 50°C for 10 min until the gel slice has completely dissolved. Vortex the tube every 2–3 min to help dissolve gel. The color of the mixture is yellow.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>4. Add 1 gel volume isopropanol to the sample and mix.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>5. Load 800 µL of each samples to the QIAquick column. Centrifuge for 1 min at 13,000 rpm and discard flow-through. Load the rest and spin again.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>6. Add 500 µL Buffer QG. Centrifuge for 1 min at 13,000 rpm and discard flow-through.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>7. Add 750 µL Buffer PE. Centrifuge for 1 min at 13,000 rpm and discard flow-through.  </p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>8. Centrifuge once more for 1 min at 13,000 rpm.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>9. Place QIAquick column into a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>10. Add 30 µL Buffer EB to the center of the QIAquick membrane, let stand for 1 min, and centrifuge for 1 min at 13,000 rpm.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>11. Store the purified DNA at 4°C before the ligation.</p>
+
 
                               </li>
 
                               </li>
  
−
                      <h3>PCR purification for digested BB1:</h3>
+
                          </ol>
−
                              <p>QIAquick PCR purification kit (qiagen, 28106), according to the protocol given by the supplier (available on https://www.qiagen.com/fi/resources/resourcedetail?id=390a728a-e6fc-43f7-bf59-b12091cc4380&lang=en)</p>  
+
                      <p><b>NB: The competency of the prepared cells will be tested the 23/03.</p></b>
−
                              <li><p>1. Add 5 volumes Buffer PB (100 µL) to 1 volume of the sample (20 µL) and mix. The color of the mixture is yellow. </p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>2. Load the sample to the QIAquick column. Centrifuge for 1 min at 13,000 rpm and discard flow-through.  </p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>3. Add 750 µL Buffer. Centrifuge for 1 min at 13,000 rpm and discard flow-through.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>4. Centrifuge once more for 1 min at 13,000 rpm.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>5. Place each QIAquick column in a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>6. Add 30 µL Buffer EB to the center of the QIAquick membrane, let stand for 1 min, and centrifuge for 1 min at 13,000 rpm .</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>7. Calculate the quantity of DNA with the Nanodrop.</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>8. Store the purified DNA at 4°C before the ligation.</p>
+
−
                              </li>
+
−
              <h4 class="blog_topHd">Results</h4>
+
−
              <h3>Electrophoresis:</h3>
+
−
              <p>Expected results / Obtained results:</p>
+
−
                                <figure class="postImg" style="width:30%;">
+
−
                                    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/3/35/2016-10-04_Expected_results_Eletrophoresis.png" alt="">
+
−
 
+
−
                                </figure>
+
−
                                <figure class="postImg" style="width:30%;">
+
−
                                    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/0/01/2016-10-04_Photo.jpg" alt="">
+
−
                                </figure>
+
−
              <h4 class="blog_topHd">Interpretation</h4>
+
−
              <p>The digestion of BBC5 was efficient, we get 2 strips at the end of the electrophoresis. The strip at 857 pb was the digested C5 that we purified for the subsequent ligation.</p>
+
−
 
+
−
                                <div class="blog_top">
+
−
                                    <h4 class="blog_topHd">
+
−
                                    Ligation of C5 into BB1  :
+
−
                                    </h4>
+
−
                                  </div>
+
−
                            <h4 class="blog_topHd">Objectives</h4>                     
+
−
            <p>Ligation of C5 into BB1 in order to obtain BBC2, for subsequent transformation and creation of a stock of bacteria.The molar ratios for the ligation were calculated using NEB BioCalculator (http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation).</p>
+
−
                            <h4 class="blog_topHd">Materials</h4>
+
−
            <h3>Concentrations of the different components after digestion and PCR purification:</h3>
+
−
                              <ul>
+
−
                              <li><p>BB1:  3.24 ng/µL (97 ng / 30 µL)</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>C5: 1.67 ng/µL (50 ng / 30 µL)</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              </ul>
+
−
                              <li><p>1. In the following order, add :</p>
+
−
                              </li>
+
−
                                <figure class="postImg ">
+
−
                                    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/f/f0/Tavleau_notebook_2.png" alt="">
+
−
                                </figure>
+
−
                                <p> NB: The ligations were done in 30 µL</p>
+
−
                              <li><p>2. Mix by pipetting</p>
+
−
                              </li>
+
−
                              <li><p>3. Incubate for 1h at room temperature</p>
+
−
                              </li>
+
  
−
                    <p>For the construction of our plasmid, we selected parts that are RFC[10] compatible.
 
−
In Figure 4 below, the map of our plasmid is represented in a simplified way, composed of the pSB1C3 backbone and the biosensor part.</p>                           
 
−
                                </div>
 
−
                               
 
−
                                </div>
 
−
                               
 
−
                                </div>                                                         
 
−
                        </div>
 
−
                       
 
 
                                     <div role="tabpanel" class="tab-pane fade" id="popular_post">
 
                                     <div role="tabpanel" class="tab-pane fade" id="popular_post">
 
                                         <div class="post_list">
 
                                         <div class="post_list">

Revision as of 15:10, 10 October 2016

Competent cells: E.Coli DH5⍺

Objectives

The objective here is to make a stock of E.Coli DH5⍺ competent cells for subsequent transformations.

Materials

Stock concentrations:

  • O/N DH5⍺ pre-culture (made the 21/03): O/N inoculation of 100 µL DH5⍺ into 100 mL LB.

  • 0.1M CaCl2: prepared the 05/06

  • 0.1M CaCl2/15% Glycerol: prepared the 05/06

    • Protocol

    Competence:

    1. Inoculation of 3 mL O/N culture in 100 mL LB in 500 mL erlenmeyer.

    2. Incubation at 250 rpm at 37°C until the DO 0,6 —> DO = 0.615

    3. Cells were transferred to 3 sterile ice-cold 50 mL Falcon tubes. 20 mL in each falcon tube.

    4. Incubate on ice for 30 min. Do not allow cells to warm up over 4°C.

    5. Spin cells at 4000 rpm for 10 min at 4°C.

    6. Discard supernatant and try to drain all remaining media.

    7. Gently resuspend on 10 mL cold 0.1M CaCl2

    8. Incubate on ice 20 min

    9. Centrifuge 10 min at 4,000 rpm at 4°C

    10. Discard supernatant and gently resuspend on 5 mL cold 0.1M CaCl2/25% Glycerol

    11. Transfer in 1.5 mL eppendorf (100 µL/tube)

    12. Store at -80°C

    NB: The competency of the prepared cells will be tested the 23/03.

    Creative and impressive building

    How you can be a super creative

    World best photographer and photography