Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week13"

(Created page with "{{Paris_Pasteur_Microbiology}} <html> <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,300,700' rel='stylesheet' type='text/css'> <style type="text/css"> b...")
 
 
(8 intermediate revisions by 3 users not shown)
Line 38: Line 38:
 
h5 {
 
h5 {
 
         display:block;
 
         display:block;
−
  font-size: 20px;
+
        font-size: 30px;
 
         color:#17A3B5;
 
         color:#17A3B5;
 
         font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 
         font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
−
  padding-top:1%;
+
        padding-top:1%;
 
         margin-left:10%;
 
         margin-left:10%;
 
}
 
}
Line 157: Line 157:
 
   position: relative;
 
   position: relative;
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 +
  text-align: center;
 
}
 
}
  
Line 169: Line 170:
 
   top: 25%;
 
   top: 25%;
 
   width: 100%;
 
   width: 100%;
 +
  text-align : center;
 
}
 
}
  
Line 205: Line 207:
 
}
 
}
  
−
 
+
#home{
 +
font-size:0;
 +
width: 20%;
 +
margin-top:1%;
 +
  margin-left:45%;
 +
}
  
 
</style>
 
</style>
 +
 +
<body>
 +
 +
  <div>
 +
 +
  <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><h2><B>Microbiology Notebook</B></h2><a/>
 +
</div>
 +
 +
<div id="home">
 +
<center></a><a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/5/5a/Labwork_pasteur.png" width="40%" alt=""/></img></a></center>
 +
</div>
 +
 +
 +
<div id= "week13">
 +
        <p><h5><B>Week 13</B></h5></p>
 +
        <p><h3><B>August 29, 2016:</B></h3></p>
 +
            <p>
 +
            <a href="#exp1"><h4> 232. Measure the amount of DNA extracted from the miniprep</h4></a><br/>
 +
            </p>
 +
            <p><h3><B>September 1, 2016:</B></h3></p>
 +
            <p>
 +
        <a href="#exp2"><h4> 233. Harvest the culture with Midiprep</h4></a><br/>
 +
    </p>
 +
    <p><h3><B>September 2, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
          <a href="#exp3"><h4> 234. Growth of bacteria </h4></a><br/>
 +
          <a href="#exp4"><h4> 235. Extraction of plasmid DNA </h4></a><br/>
 +
 +
    </p>
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp1">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) before sending for sequencing (inserts B1 and C2)<br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; Nanodrop (Thermofisher)<br/>
 +
                  &bull; Elution buffer from QIAGEN kit<br/>
 +
                  &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>)<br/><br/>
 +
 +
                  <U>Method:</U><br/>
 +
                  1. Analyze absorbance at 260nm<br/>
 +
                  2. Clean the Nanodrop with water<br/>
 +
                  3. Make the blank with 1&#181;l of elution buffer<br/>
 +
                  4. Put 1 &#181;l of your sample on the Nanodrop<br/>
 +
                  5. Make the measure and clean the Nanodrop between each measure <br/><br/>
 +
 +
                <U>Results:</U><br/>
 +
                <table>
 +
                  <caption align="bottom" align="center"><i><p>Table 1 : Absorbance</p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Absorbance at 260nm</th>
 +
                            <th>A<sub>260</sub></th>
 +
                            <th>A<sub>280</sub></th>
 +
                            <th>A<sub>260/280</sub<</th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;l)</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1(1)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.202 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.124</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.62 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">10.1</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1(2)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.259 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.169</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.53 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">13.0 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(1)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.179</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.105</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.70 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">8.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(2)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.179 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.103</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.73</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">8.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(3)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.098 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.052</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.86 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">4.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(4)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.152 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.099</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.53</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">7.6 </td>
 +
                          </tr>
 +
                                              </tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
                  <br/><br/><br/>
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp2">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
              <figcaption>
 +
                  <p><U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert C2 in pET43.1a in BL21(DE3) from 22/08 and A1/C2 in pET43.1a in TOP1O. <br/>
 +
                  In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.
 +
                <br/><br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/4/4b/T--Pasteur_Paris--Bacterial_culture_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
                  <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
                  <U>Materials:</U><br/>
 +
                    &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>) <br/>
 +
                    &bull; 50 ml erlenmeyers<br/>
 +
                    &bull; Carbenicillin 50 mg/ml<br/>
 +
                    &bull; LB medium<br/><br/>
 +
 +
                  <U>Method:</U><br/>
 +
                  1. One colony is picked from the plates and shaken in 25.0 ml of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml.<br/>
 +
                  2. The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight.<br/>
 +
                  <br/><br/><br/>
 +
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp3">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
              <figcaption>
 +
                  <p><U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.<br/><br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/a4/T--Pasteur_Paris--Protein_induction_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
                  <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
                  <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; Two 2 l erlenmeyers<br/>
 +
                  &bull; LB (Luria broth)<br/>
 +
                  &bull; IPTG (0.1 M)<br/>
 +
                  &bull; Precultures in 25 ml Erlenmeyers<br/>
 +
                  &bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)<br/>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)<br/>
 +
                  &bull; Centrifuge<br/>
 +
                  &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)<br/><br/>
 +
 +
                  <U>Method:</U><br/>
 +
                  1. Put 1 l of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150 rpm.<br/>
 +
                  2. Once warmed, add 12.5 ml of preculture in each erlenmeyer.<br/>
 +
                  3. Let grow in the shaking incubator.<br/>
 +
                  4. Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min<br/>
 +
 +
                  <table>
 +
                  <caption align="bottom" align="center"><i><p><U>Table 140 :</U> Optical Density</p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Time</th>
 +
                            <th>C2 (1)</th>
 +
                            <th>C2 (2)</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>9:36<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.024 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.023 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>10:06<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.049</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.046 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>11:02<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.175</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.165</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>11:36<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.395 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.402 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>12:05<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.568</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.540 </td>
 +
                          </tr>       
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>12:27<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.658 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.638</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>12:38<sub>AM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.694 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.680 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>14:31<sub>PM</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.872 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.859 </td>
 +
                          </tr>
 +
                      </tbody>
 +
                  </table></br>
 +
 +
                    5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1mM. (12:57<sub>AM</sub>)<br/>
 +
                    6. The last measure before induction is pelleted 3min at 8000g and stored at -20°C.<br/>

 +
                    7. Let induce overnight in the shaking incubator<br/>
 +
                    8. After 7 hours of induction, measure the OD<sub>600 nm</sub> and store the measure pelleted at -20°C.<br/>
 +
                    9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.
 +
                    <br/><br/><br/>
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp4">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1(a+) with the inserts A1/C2 from cultures made on the 1<sup>set</sup> of August. <br/>
 +
The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep.<br/><br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/d/d5/T--Pasteur_Paris--Miniprep_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; 50 ml Falcon tube<br/>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)<br/>
 +
                  &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41)<br/>
 +
                  &bull; QIAGEN Miniprep kit</br>
 +
                  &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>)<br/><br/>
 +
 +
                <U>Method:</U><br/>
 +
                  The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below.<br/>
 +
                Follow QIAGEN kit steps with a final volume of 100 &#181;l<br/>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
</body>
 +
</html>

Latest revision as of 03:38, 20 October 2016