Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week14"

 
(21 intermediate revisions by 3 users not shown)
Line 157: Line 157:
 
   position: relative;
 
   position: relative;
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 +
  text-align : center;
 
}
 
}
  
Line 169: Line 170:
 
   top: 25%;
 
   top: 25%;
 
   width: 100%;
 
   width: 100%;
 +
  text-align : center;
 
}
 
}
  
Line 211: Line 213:
 
   margin-left:45%;  
 
   margin-left:45%;  
 
}
 
}
 +
  
 
</style>
 
</style>
Line 226: Line 229:
  
  
−
  <div id="week15">
+
  <div id="week14">
−
    <p><h5><B>September 12, 2016:</B></h5></p>
+
  <p><h5><B>Week 14</B></h5></p>
 +
 
 +
    <p><h3><B>September 6, 2016:</B></h3></p>
 
     <p>
 
     <p>
−
         <a href="#exp1"><h4> Digestion of the plasmid pSB1C3 </a></br>
+
         <a href="#exp1"><h4> 236. Growth of bacteria </h4></a></br>  
 
   </p>
 
   </p>
−
     <p><h5><B>September 15, 2016:</B></h5></p>
+
     <p><h3><B>September 7, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp2"><h4> 237. Purification of the protein </h4></a></br>
 +
    </p>
 +
    <p><h3><B>September 8, 2016:</B></h3></p>
 
     <p>
 
     <p>
−
        <a href="#exp6"><h4> Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>  
+
          <a href="#exp3"><h4> 238. Protein gel on SDS-PAGE </h4></a></br>
 +
          <a href="#exp4"><h4> 239. Harvest the culture with Miniprep </h4></a></br>
  
−
        <a href="#exp7"><h4> Digestion of the plasmid pSB1C3 and inserts A1/A2/B1/B2/C1/C2/D1/D2/E1/E2 </h4></a></br>
 
−
        <a href="#exp8"><h4>Electrophoresis on agarose gel</h4></a></br>
 
−
        <a href="#exp9"><h4>DNA extraction</h4></a></br>
 
 
     </p>
 
     </p>
−
    <p><h5><B>September 16, 2016:</B></h5></p>
+
<p><h3><B>September 9, 2016:</B></h3></p>
 
     <p>
 
     <p>
−
           <a href="#exp10"><h4> Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>
+
           <a href="#exp5"><h4> 240. Extraction of plasmid DNA </h4></a></br>
 +
          <a href="#exp6"><h4> 241. Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>
 +
 
 
     </p>
 
     </p>
 +
 +
  
 
     <div class="lightbox" id="exp1">
 
     <div class="lightbox" id="exp1">
Line 249: Line 260:
 
             <figcaption>   
 
             <figcaption>   
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> To have the right restriction sites to perform the ligation and the cloning.</br>
+
               <U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an OD<sub>600 nm</sub> of 0.7.</br> </br>  
−
                We choose appropriate restriction sites based on our inserts.</br></br>
+
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/a4/T--Pasteur_Paris--Protein_induction_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
−
 
+
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
 
               <U>What we did in the lab:</U></br>
 
               <U>What we did in the lab:</U></br>
 
               <U>Materials:</U></br>
 
               <U>Materials:</U></br>
−
                &bull; Restriction enzymes: XbaI, SpeI (New England Biolabs, NEB)</br>
+
                  &bull; Two 2 l erlenmeyers</br>
−
                &bull; Restriction enzyme buffers </br>
+
                  &bull; LB (Luria broth)</br>  
−
                &bull; 37°C water bath</br>
+
                  &bull; IPTG (0.1 M)</br>  
−
                &bull; UV spectrophotometer</br>
+
                  &bull; Precultures in 25 ml erlenmeyers</br>  
−
                &bull; pSB1C3 (48ng/&#181;L)</br></br>
+
                  &bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)</br>  
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
 +
                  &bull; Centrifuge</br>
 +
                  &bull; Buffer A (Tris-Cl 50 mM pH 7.4, NaCl 150 mM)</br> </br>  
  
 +
                  <U>Method:</U></br>
 +
                  1. Put 1 l of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150 rpm.<br/>
 +
                  2. Once warmed, add 12.5 ml of preculture in each erlenmeyer.<br/>
 +
                  3. Let grow in the shaking incubator.<br/>
 +
                  4. Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30 minutes.</br> </br>
  
−
                 <U>Method:</U></br>
+
                 <table>
−
                Mix all the reagents and let digest during 1 hr at 37°C </br></br>
+
                  <caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 141 :</U> Optical Density </p></i></caption>
−
                Big volumes must be added first!</br></br>
+
−
 
+
−
              <table>
+
 
                     <thead>
 
                     <thead>
 
                         <tr>
 
                         <tr>
−
                             <th>Reactants</th>
+
                             <th>Time</th>
−
                             <th>pSB1C3</th>
+
                             <th>C2 (1)</th>
 +
                            <th>C2 (2)</th>
 
                         </tr>
 
                         </tr>
 
                   </thead>
 
                   </thead>
 
                     <tbody>
 
                     <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>Vol<sub>DNA</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>10:30 <sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>25 &#181;L </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>Vol<sub>XbaI</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>01:55 <sub>PM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>10 &#181;L </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.438</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">/</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>Vol<sub>SpeI</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>2:25 <sub>PM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>10 &#181;L </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.602</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.429 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>Vol<sub> buffer (10X) (Cutsmart) </sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>2:45 <sub>PM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>5 &#181;L </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.679</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.600 </td>
 
                           </tr>         
 
                           </tr>         
−
                          <tr>
 
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>total</sub></p></strong></td>
 
−
                            <td>50 &#181;L </td>
 
−
                          </tr>
 
 
                       </tbody>
 
                       </tbody>
−
                   </table>
+
                   </table><br/>
−
                  <center>Volumes</center></br></br></br>
+
  
−
                  2. Incubate 10 min at 65°C to inactivate the enzymes.</br>
+
                5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1 mM. (3:00 <sub>PM</sub>)</br>  
−
                  3. Add 2 &#181;L of rSAP in order to perform the dephosphorylation.</br>
+
                6. The last measure before induction is pelleted 3 min at 8000g and stored at -20°C.</br> 

−
                  3. Store at -20°C</br></br>
+
                7. Let induce overnight in the shaking incubator at 15°C at 150 rpm</br>  
 +
                8. The day after, measure the OD<sub>600 nm</sub> and store the measure pelleted at -20°C.</br>  
 +
                9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.</br>
 +
<br/><br/><br/>  
  
 
             </p>
 
             </p>
Line 306: Line 323:
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
 +
      </p>
  
  
Line 313: Line 331:
 
             <figcaption>   
 
             <figcaption>   
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher)</br></br>
+
               <U> Aim:</U> Purifying the protein C2 produced by BL21(DE3) using a Fast Purification Liquid Chromatography. We use the culture induced the previous day. </br> </br>
−
 
+
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/0/07/T--Pasteur_Paris--FPLC_Protein_purification_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 
               <U>What we did in the lab:</U></br>
 
               <U>What we did in the lab:</U></br>
 
               <U>Materials:</U></br>
 
               <U>Materials:</U></br>
−
                 &bull; Nanodrop (Thermofisher)</br>
+
                 &bull; Fast Purification Liquid Chromatography </br>
−
                 &bull; Elution buffer from QIAGEN kit</br>
+
                &bull; Chaotropic reagent (Guanidinium HCL 6 M) </br>
−
                 &bull; Microbiology equipment (Follow this link)</br></br>
+
                 &bull; EDTA 0,1 M </br>
 +
                &bull; PMSF (100 mM) </br>
 +
                &bull; Ni<sup>2+</sup> solution (100 mM) </br>
 +
                &bull; Centrifuge </br>
 +
                &bull; Buffer A (Tris 50 mM pH 7.4, NaCl 150 mM) </br>
 +
                 &bull; Buffer B (Tris 50 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, Imidazole 250 mM) </br> </br>
  
−
              <U>Method:</U></br>
+
                <U>Method:</U></br>
−
              Analyze absorbance at 260nm</br>
+
                1. Melt the pellet of bacteria C2 (from 1 l culture) and resuspend it with 10 ml of buffer A. We add 25 ml of pellet we complete until 40 ml with buffer A. </br>
−
              Clean the Nanodrop with water</br>
+
                2. Add 40 &#181;l of PMSF to avoid protein denaturation. </br>
−
              Make the blank with 1ul of elution buffer</br>
+
                3. Put the column on the FPLC, clean the FPLC with water and then fill it with buffer A. </br>
−
              Put 1ul of your sample on the Nanodrop</br>
+
                4. Sonicate the sample three times one minute at 60%, wait 90 seconds between each sonication. </br>
−
              Make the measure and clean the Nanodrop between each measure</br></br>
+
                5. Centrifuge 25 min at 16000g (rotor Beckman JA 25.50) </br>
−
 
+
                6. Inject your sample in the FPLC </br>
−
                  <U>Results:</U></br>
+
                7. Get back several samples: </br>
−
                  <table>
+
                  &emsp; &#8594; C: Crude extract : before centrigugation </br>
−
                        <thead>
+
                  &emsp; &#8594; P: Pellet </br>
−
                        <tr>
+
                  &emsp; &#8594; SN: Supernatant </br>
−
                            <th>Absorbance at 260nm</th>
+
                  &emsp; &#8594; F: Flow through (unfixed proteins) </br>
−
                            <th>A260/280</th>
+
                  &emsp; &#8594; W: Wash 5% of buffer B </br>
−
                            <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>
+
                  &emsp; &#8594; Fractions (depending on the gradient) </br>  
−
                        </tr>
+
<br/><br/><br/>
−
                  </thead>
+
              </p>
−
                    <tbody>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>pSB1C3 (1)</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.94</td>
+
−
                            <td>115.7</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>pSB1C3 (2)</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.93</td>
+
−
                            <td>13.0</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>B1-col6</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.88</td>
+
−
                            <td>393.3</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>B1-col8<sub>(diluted 1/2)</sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>1.93</td>
+
−
                            <td>74.1</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>B2-col7</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.89 </td>
+
−
                            <td>84.8</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>B2-col9</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.90 </td>
+
−
                            <td>307.1</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                        </tbody>
+
−
                  </table>
+
−
                  <center>Absorbance</center></br></br></br>
+
−
 
+
−
            </p>
+
 
           </figcaption>
 
           </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
Line 378: Line 365:
  
  
−
     <div class="lightbox" id="exp7">
+
 
 +
 
 +
     <div class="lightbox" id="exp3">
 
       <figure>
 
       <figure>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
             <figcaption>   
 
             <figcaption>   
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> To have the right restriction sites to perform the ligation and the cloning.</br>
+
               <U> Aim:</U> Get the size of the protein purified thanks to FPLC in order to know if it is our protein. <br/><br/>
−
                We choose appropriate restriction sites based on our inserts.</br></br>
+
  
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
              <U>Material: </U>
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
              &bull; SDS-PAGE chamber <br/>
−
              <U>Materials:</U></br>
+
              &bull; SDS-PAGE gel 4-15% gradient (BIORAD) <br/>
−
                  &bull; Restriction enzymes: XbaI, SpeI (New England Biolabs, NEB)</br>
+
              &bull; Protein migration buffer TGS 20X <br/>
−
                  &bull; Restriction enzyme buffers </br>
+
              &bull; Protein ladder PAGE Ruler (Thermofisher)<br/>
−
                  &bull; 37°C water bath</br>
+
              &bull; Laemmli 2X <br/>
−
                  &bull; UV spectrophotometer</br>
+
              &bull; Coomassie Blue <br/>
−
                  &bull; pSB1C3 (48ng/&#181;L)</br></br>
+
              &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>) <br/><br/>
  
−
                  <U>Method:</U></br>
+
              <U>Method:</U><br/>
−
                  Mix all the reagents and let digest during 1 hr at 37°C </br></br>
+
            1. In nine 1.5 ml Eppendorf, put 20 &#181;l of a sample and 20 &#181;l of Laemmli 2X. <br/>
−
                  Big volumes must be added first!</br></br>
+
            2. Let denaturate the proteins 5 minutes at 95°C. <br/>
 +
              3. Place the gel into the chamber and fill it with migration buffer. <br/>
 +
              4. Follow the next deposit table: <br/><br/>
  
 +
              &emsp; Fraction 13 &#124; Fraction 15 &#124; Fraction 17 &#124; Fraction 19 &#124; Fraction 21 &#124; Fraction 23 &#124; Fraction 25 &#124; Fraction 27 &#124; Protein gene ruler (8 &#181;l)</br><br/>
  
−
                <table>
+
              5. Launch the migration at 130V. <br/>
−
                    <thead>
+
              6. Wash the gel three times with distilled water during 5 minutes. <br/>
−
                        <tr>
+
              7. Color the gel with Coomassie Blue diluted 1/5 during 30 minutes. <br/>
−
                            <th>Reactants</th>
+
              8. Wash with distilled water for 5 minutes then let wash 15 minutes. <br/>
−
                            <th>Each sample</th>
+
              <br/><br/><br/>
−
                            <th>Global mix</th>
+
              </p>
−
                        </tr>
+
−
                  </thead>
+
−
                    <tbody>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>DNA</sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>25 &#181;L </td>
+
−
                            <td>0 &#181;L </td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>XbaI </sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>1 &#181;L </td>
+
−
                            <td>18 &#181;L </td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>SpeI</sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>0.5 &#181;L </td>
+
−
                            <td>9 &#181;L </td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>buffer 2.1</sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>5 &#181;L </td>
+
−
                            <td>90 &#181;L </td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>H<span>2</span>O</sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>18.5 &#181;L </td>
+
−
                            <td>333 &#181;L </td>
+
−
                          </tr>       
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>Vol<sub>total</sub></p></strong></td>
+
−
                            <td>50 &#181;L </td>
+
−
                            <td>450 &#181;L </td>
+
−
                      </tbody>
+
−
                  </table>
+
−
                  <center>Volumes</center></br></br></br>
+
−
 
+
−
 
+
−
                    2. Incubate 10 min at 65°C to inactivate the enzymes.</br>
+
−
                    3. Add 2 &#181;L of rSAP in order to perform the dephosphorylation.</br>
+
−
                    3. Store at -20°C</br></br>
+
−
     
+
−
            </p>
+
 
           </figcaption>
 
           </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
  
−
     <div class="lightbox" id="exp8">
+
 
 +
 
 +
 
 +
     <div class="lightbox" id="exp4">
 
       <figure>
 
       <figure>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
             <figcaption>   
 
             <figcaption>   
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> This step check the digestion efficiency of B1 (2 tubes)/B2 (2 tubes)/ C1 / C2 / A1 / A2 / D2 / E1 / E2.</br> Moreover, the inserts will be purified during this step because they will be extracted from the gel.</br>
+
               <U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2. <br/>
 +
                In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.<br/><br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/4/4b/T--Pasteur_Paris--Bacterial_culture_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>) <br/>
 +
                &bull; 15 ml Falcons <br/>
 +
                &bull; Carbenicillin 50 mg/ml <br/>
 +
                &bull; LB medium <br/><br/>
  
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
                <U>Method:</U><br/>
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
                1. One colony is picked from the plates and shaken in 5.0 ml of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml. <br/>
−
              <U>Materials:</U></br>
+
                2. The flask is placed in a shaking incubator at 37°C and 150 rpm overnight. <br/>
−
                  &bull; Electrophoresis cuve</br>
+
<br/><br/><br/>
−
                  &bull; TAE 1X</br>
+
              </p>
−
                  &bull; Gene ruler (Thermoscientific 1kb plus)</br>
+
            </figcaption>
−
                  &bull; Loading dye</br>
+
      </figure>
−
                  &bull; Agarose</br>
+
    </div>
−
                  &bull; UV table </br>
+
−
                  &bull; BET</br></br>
+
  
  
−
                  <U>Method:</U></br> Each well will contain 25 &#181;L of DNA and 6 &#181;L of Loading Dye. Follow the next deposit table :</br></br>
+
    <div class="lightbox" id="exp5">
−
 
+
      <figure>
−
                  Line 1:</br>
+
          <a href="#" class="closemsg"></a>
−
                  Ladder (6 &#181;L) /// B2-col7 /// B2-col9 /// B1-col6 /// B1-col9 /// C1 /// C2</br></br>
+
            <figcaption>
−
 
+
              <p>
−
                  Line 2:</br>
+
              <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1(a+) with the inserts A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 from cultures made on the 8/09. <br/>
−
                  Ladder (6 &#181;L) /// D2 /// E1 /// E2 /// pSB1C€3 /// A1 /// A2</br></br>
+
The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep. <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/d/d5/T--Pasteur_Paris--Miniprep_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
              &bull; 50 ml Falcon tube <br/>
 +
              &bull; Shaking incubator (INFORS HT) <br/>
 +
              &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41) <br/>
 +
              &bull; QIAGEN Miniprep kit <br/>
 +
              &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>) <br/><br/>
  
 +
            <U>Method:</U><br/>
 +
              1. The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500g so we used 3500g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below. <br/>
 +
          2. Follow QIAGEN kit steps. Final volume: 100 &#181;l <br/>
 +
<br/><br/><br/>
 
             </p>
 
             </p>
 
           </figcaption>
 
           </figcaption>
Line 484: Line 454:
 
     </div>
 
     </div>
  
−
     <div class="lightbox" id="exp9">
+
 
 +
     <div class="lightbox" id="exp6">
 
       <figure>
 
       <figure>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
             <figcaption>   
 
             <figcaption>   
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> To perform a gel extraction to isolate insert DNA purified from its plasmid thanks to the migration. We use the gel made before with inserts B1 (2 tubes)/B2 (2 tubes)/ C1 / C2 / A1 / A2 / D2 / E1 / E2 but we only extract B2 bands.</br> </br>
+
               <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) <br/><br/>
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
−
              <U>Materials:</U></br>
+
−
                &bull; scalpel</br>
+
−
                &bull; 2 ml eppendorfs</br>
+
−
                &bull; balance</br>
+
−
                &bull; UV table</br>
+
−
                &bull; microbiology equipment</br>
+
−
                &bull; QIAGEN Gel Extraction Kit</br>
+
−
                </br></br>
+
−
                              <U>Method:</U></br>
+
−
                Be aware of the risks! UV light burns the eyes and skin so make sure you have the right protection</br>
+
  
−
                Follow QIAGEN Kit steps according to the next tables for the volumes of QG buffer. </br></br>
+
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                    &bull; Nanodrop (Thermofisher) <br/>
 +
                    &bull; Elution buffer from QIAGEN kit <br/>
 +
                    &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>)<br/><br/>
  
−
                  <table>
+
                <U>Method:</U><br/>
 +
                1. Analyze absorbance at 260nm. <br/>
 +
                2. Clean the Nanodrop with water. <br/>
 +
                3. Make the blank with 1 &#181;l of elution buffer. <br/>
 +
                4. Put 1 &#181;l of your sample on the Nanodrop. <br/>
 +
                5. Make the measure and clean the Nanodrop between each measure. <br/><br/>
 +
 
 +
                <U>Results:</U><br/>
 +
                <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p><U>Table 142 :</U> Absorbance</p></i></caption>
 
                     <thead>
 
                     <thead>
 
                         <tr>
 
                         <tr>
−
                             <th>Insert</th>
+
                             <th>Absorbance at 260nm</th>
−
                             <th>Mass of gel (mg)</th>
+
                             <th>A<sub>260</sub></th>
−
                             <th>Volume of QG Buffer (&#181;L )</th>
+
                             <th>A<sub>280</sub></th>
 +
                            <th>A<sub>260/280</sub></th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;l)</th>
 
                         </tr>
 
                         </tr>
 
                   </thead>
 
                   </thead>
 
                     <tbody>
 
                     <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B2-col7</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1</p></strong></td>
−
                             <td>190</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.645</td>
−
                             <td>570</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.345</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.87</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">32.3</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B2-col9</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1’ <sub>(diluted 1/2)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>170</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">1.314</td>
−
                             <td>510</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.704</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.86 </td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">65.7 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B1-col6</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>80</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">1.404</td>
−
                             <td>240</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.752</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.87 </td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">70.2</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B1-col8</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2’<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>140</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.494</td>
−
                             <td>420</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.269</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.87</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">24.7</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>C1</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>C1<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                            <td>150</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.305 </td>
−
                             <td>450</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.165</td>
−
                          </tr>       
+
                             <td align="center"; valign="center">1.85 </td>
−
                          <tr>
+
                             <td align="center"; valign="center">15.2 </td>
−
                             <td><strong><p>C2</p></strong></td>
+
−
                             <td>130</td>
+
−
                             <td>390</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>D2</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>C1’<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>150</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.812 </td>
−
                             <td>450</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.445</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.83</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">40.6</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>E1</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>C2<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>150</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.499 </td>
−
                             <td>450</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.272</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.83</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">24.9 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>E2</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>C2’<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>180</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.757 </td>
−
                             <td>540</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.402</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.88</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">37.8</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>pSB1C3</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>D1<sub>(diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
−
                             <td>210</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.441 </td>
−
                             <td>630</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.233</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.89</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">22.1 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A1</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>D1’<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>170</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.725</td>
−
                             <td>510</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.396</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.83</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">36.3</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>D2<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>210</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.264 </td>
−
                             <td>630</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.141</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.87</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">13.2</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
−
                      </tbody>
 
−
                  </table>
 
−
                  <center>Masses</center></br></br></br>
 
−
 
−
 
−
 
−
  <div class="lightbox" id="exp10">
 
−
      <figure>
 
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 
−
            <figcaption> 
 
−
              <p>
 
−
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher)</br>
 
−
 
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 
−
              <U>Materials:</U></br>
 
−
                &bull; Nanodrop (Thermofisher)</br>
 
−
                &bull; Elution buffer from QIAGEN kit</br>
 
−
                &bull; Microbiology equipment (Follow this link)</br></br>
 
−
 
−
              <U>Method:</U></br>
 
−
              Analyze absorbance at 260nm</br>
 
−
              Clean the Nanodrop with water</br>
 
−
              Make the blank with 1ul of elution buffer</br>
 
−
              Put 1ul of your sample on the Nanodrop</br>
 
−
              Make the measure and clean the Nanodrop between each measure</br></br>
 
−
 
−
              <U>Results:</U></br>
 
−
 
−
                  <table>
 
−
                    <thead>
 
−
                        <tr>
 
−
                            <th>Absorbance at 260nm</th>
 
−
                            <th>A260/280</th>
 
−
                            <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>
 
−
                        </tr>
 
−
                  </thead>
 
−
                    <tbody>
 
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B2-col7</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>D2’<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>2.12</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.418 </td>
−
                             <td>3.7</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.216</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.94</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">20.9 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B2-col9</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>E1<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>2.19</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.487 </td>
−
                             <td>5.3</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.266</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.83</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">24.3</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B1-col6</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>E1’<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>2.04</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.478 </td>
−
                             <td>3.2</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.247</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.94</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">24.0</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>B1-col8</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>E2<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>1.98</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">1.364</td>
−
                             <td>3.7</td>
+
                            <td align="center"; valign="center">0.742</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.84</td>
 +
                             <td align="center"; valign="center">68.2</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>C1</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>E2’<sub>(diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
−
                             <td>1.78 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">1.041 </td>
−
                             <td>5.0</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.562</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.85</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">52.1</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
−
                          <tr>
+
                             </tbody>
−
                            <td><strong><p>C2</p></strong></td>
+
                   </table><br/>
−
                            <td>1.90 </td>
+
<br/><br/><br/>
−
                            <td>307.1</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>D2</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.84 </td>
+
−
                            <td>5.2</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>E1</p></strong></td>
+
−
                            <td>2.30 </td>
+
−
                            <td>3.9</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>E2</p></strong></td>
+
−
                            <td>2.17 </td>
+
−
                            <td>3.8</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>pSB1C3</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.98</td>
+
−
                            <td>13.1</td>
+
−
                          </tr>                     
+
−
                             <tr>
+
−
                            <td><strong><p>A1</p></strong></td>
+
−
                            <td>2.11</td>
+
−
                            <td>4.8</td>
+
−
                          </tr>                       
+
−
                            <tr>
+
−
                            <td><strong><p>A2</p></strong></td>
+
−
                            <td>2.45</td>
+
−
                            <td>4.3</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                        </tbody>
+
−
                   </table>
+
−
                  <center>Absorbance</center></br></br></br>
+
  
 
             </p>
 
             </p>
Line 679: Line 608:
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
−
 
  
 
</body>
 
</body>
 +
 
</html>
 
</html>

Latest revision as of 03:47, 20 October 2016