Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week15"

(Created page with "{{Paris_Pasteur_Microbiology}} <html> <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,300,700' rel='stylesheet' type='text/css'> <style type="text/css"> b...")
 
 
(9 intermediate revisions by 3 users not shown)
Line 38: Line 38:
 
h5 {
 
h5 {
 
         display:block;
 
         display:block;
−
  font-size: 20px;
+
        font-size: 30px;
 
         color:#17A3B5;
 
         color:#17A3B5;
 
         font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 
         font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
−
  padding-top:1%;
+
        padding-top:1%;
 
         margin-left:10%;
 
         margin-left:10%;
 
}
 
}
Line 157: Line 157:
 
   position: relative;
 
   position: relative;
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 +
  text-align : center;
 
}
 
}
  
Line 169: Line 170:
 
   top: 25%;
 
   top: 25%;
 
   width: 100%;
 
   width: 100%;
 +
  text-align : center;
 
}
 
}
  
Line 205: Line 207:
 
}
 
}
  
−
 
+
#home{
 +
font-size:0;
 +
width: 20%;
 +
margin-top:1%;
 +
  margin-left:45%;
 +
}
  
 
</style>
 
</style>
 +
 +
<body>
 +
 +
  <div>
 +
 +
  <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><h2><B>Microbiology Notebook</B></h2><a/>
 +
</div>
 +
 +
<div id="home">
 +
<center></a><a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/5/5a/Labwork_pasteur.png" width="40%" alt=""/></img></a></center>
 +
</div>
 +
 +
 +
<div id="week15">
 +
<p><h5><B>Week 15</B></h5></p>
 +
    <p><h3><B>September 12, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp1"><h4> 242. Digestion of the plasmid pSB1C3 </h4></a></br>
 +
  </p>
 +
    <p><h3><B>September 15, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp2"><h4> 243. Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>
 +
 +
        <a href="#exp3"><h4> 244. Digestion of the plasmid pSB1C3 and inserts A1/A2/B1/B2/C1/C2/D1/D2/E1/E2 </h4></a></br>
 +
        <a href="#exp4"><h4> 245. Electrophoresis on agarose gel</h4></a></br>
 +
        <a href="#exp5"><h4> 246. DNA extraction</h4></a></br>
 +
    </p>
 +
    <p><h3><B>September 16, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
          <a href="#exp6"><h4> 247. Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>
 +
    </p>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp1">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To have the right restriction sites to perform the ligation and the cloning.</br>
 +
                We choose appropriate restriction sites based on our inserts.</br></br>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/ab/T--Pasteur_Paris--Restriction_digestion_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                &bull; Restriction enzymes: Xba I, Spe I (New England Biolabs, NEB)</br>
 +
                &bull; Restriction enzyme buffers </br>
 +
                &bull; 37&#176;C water bath</br>
 +
                &bull; UV spectrophotometer</br>
 +
                &bull; pSB1C3 (48ng/&#181;l)</br></br>
 +
 +
                <U>Method:</U></br>
 +
              1. Mix all the reagents and let digest during 1 hour at 37&#176;C </br>
 +
                &emsp;&#9888; Big volumes must be added first!</br>
 +
 +
              <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 143</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Reactants</th>
 +
                            <th>pSB1C3</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>DNA</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">25 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>XbaI</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">10 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>SpeI</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">10 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub> buffer (10X) (Cutsmart) </sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">5 &#181;l </td>
 +
                          </tr>       
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>total</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">50 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                      </tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
 +
                  2. Incubate 10 min at 65&#176;C to inactivate the enzymes.</br>
 +
                  3. Add 2 &#181;l of rSAP in order to perform the dephosphorylation.</br>
 +
                  3. Store at -20&#176;C</br>
 +
<br/><br/><br/>
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp2">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher)</br></br>
 +
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                &bull; Nanodrop (Thermofisher)</br>
 +
                &bull; Elution buffer from QIAGEN kit</br>
 +
                &bull; Microbiology equipment (Follow this link)</br></br>
 +
 +
              <U>Method:</U></br>
 +
              1. Analyze absorbance at 260 nm</br>
 +
              2. Clean the Nanodrop with water</br>
 +
              3. Make the blank with 1&#956;l of elution buffer</br>
 +
              4. Put 1&#956;l of your sample on the Nanodrop</br>
 +
              5. Make the measure and clean the Nanodrop between each measure</br></br>
 +
 +
                  <U>Results:</U></br>
 +
                  <table>
 +
                      <caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 144 :</U> Absorbance </p></i></caption>
 +
                        <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Absorbance at 260nm</th>
 +
                            <th>A260/280</th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;l )</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>pSB1C3 (1)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.94</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">115.7</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>pSB1C3 (2)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.93</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">13.0</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B1-col6</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.88</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">393.3</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B1-col8<sub>(diluted 1/2)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.93</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">74.1</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B2-col7</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.89 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">84.8</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B2-col9</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.90 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">307.1</td>
 +
                          </tr>
 +
                        </tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
<br/><br/><br/>
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp3">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To have the right restriction sites to perform the ligation and the cloning.</br>
 +
                We choose appropriate restriction sites based on our inserts.</br></br>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/ab/T--Pasteur_Paris--Restriction_digestion_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                  &bull; Restriction enzymes: Xba I, Spe I (New England Biolabs, NEB)</br>
 +
                  &bull; Restriction enzyme buffers </br>
 +
                  &bull; 37&#176;C water bath</br>
 +
                  &bull; UV spectrophotometer</br>
 +
                  &bull; pSB1C3 (48ng/&#181;l)</br></br>
 +
 +
                  <U>Method:</U></br>
 +
                  Mix all the reagents and let digest during 1 hour at 37&#176;C </br></br>
 +
                  &emsp; &#9888; Big volumes must be added first!</br></br>
 +
 +
 +
                <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 145</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Reactants</th>
 +
                            <th>Each sample</th>
 +
                            <th>Global mix</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>DNA</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">25 &#181;l </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>XbaI </sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1 &#181;l </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">18 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>SpeI</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.5 &#181;l </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">9 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>buffer 2.1</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">5 &#181;l </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">90 &#181;l </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>H<span>2</span>O</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">18.5 &#181;l </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">333 &#181;l </td>
 +
                          </tr>       
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>Vol<sub>total</sub></p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">50 &#181;l </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">450 &#181;l </td>
 +
                      </tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
 +
                    2. Incubate 10 min at 65&#176;C to inactivate the enzymes.</br>
 +
                    3. Add 2 &#181;l of rSAP in order to perform the dephosphorylation.</br>
 +
                    3. Store at -20&#176;C</br>
 +
      <br/><br/><br/>
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp4">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> This step check the digestion efficiency of B1 (2 tubes)/B2 (2 tubes)/ C1 / C2 / A1 / A2 / D2 / E1 / E2.</br> Moreover, the inserts will be purified during this step because they will be extracted from the gel.</br><br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/60/T--Pasteur_Paris--Gel_electrophoresis_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                  &bull; Electrophoresis cuve</br>
 +
                  &bull; TAE 1X</br>
 +
                  &bull; Gene ruler (Thermoscientific 1kb plus)</br>
 +
                  &bull; Loading dye</br>
 +
                  &bull; Agarose</br>
 +
                  &bull; UV table </br>
 +
                  &bull; Ethidium bromide drops (EB)</br></br>
 +
 +
 +
                  <U>Method:</U></br> Each well will contain 25 &#181;l of DNA and 6 &#181;l of Loading Dye. Follow the next deposit table :</br></br>
 +
 +
                  Line 1:</br>
 +
                  Ladder (6 &#181;l) &#124; &#216; &#124; B2-col7 &#124; &#216; &#124; B2-col9 &#124; &#216; &#124; B1-col6 &#124; &#216; &#124; B1-col9 &#124; &#216; &#124; C1 &#124; &#216; &#124; C2</br></br>
 +
 +
                  Line 2:</br>
 +
                  Ladder (6 &#181;l) &#124; &#216; &#124; D2 &#124; &#216; &#124; E1 &#124; &#216; &#124; E2 &#124; &#216; &#124; pSB1C€3 &#124; &#216; &#124; A1 &#124; &#216; &#124; A2</br></br>
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp5">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To perform a gel extraction to isolate insert DNA purified from its plasmid thanks to the migration. We use the gel made before with inserts B1 (2 tubes)/B2 (2 tubes)/ C1 / C2 / A1 / A2 / D2 / E1 / E2 but we only extract B2 bands.</br> </br>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/d/d5/T--Pasteur_Paris--Miniprep_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                &bull; Scalpel</br>
 +
                &bull; 2 ml Eppendorfs</br>
 +
                &bull; Balance</br>
 +
                &bull; UV table</br>
 +
                &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>)
 +
                &bull; QIAGEN Gel Extraction Kit</br>
 +
                </br></br>
 +
                              <U>Method:</U></br>
 +
                &emsp; &#9888; Be aware of the risks! UV light burns the eyes and skin so make sure you have the right protection</br>
 +
 +
                Follow QIAGEN Kit steps according to the next tables for the volumes of QG buffer. </br></br>
 +
 +
                  <table>
 +
                  <caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 146 :</U> Masses </p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Insert</th>
 +
                            <th>Mass of gel (mg)</th>
 +
                            <th>Volume of QG Buffer (&#181;l)</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B2-col7</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">190</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">570</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B2-col9</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">170</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">510</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B1-col6</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">80</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">240</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B1-col8</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">140</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">420</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>C1</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">150</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">450</td>
 +
                          </tr>       
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>C2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">130</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">390</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>D2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">150</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">450</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>E1</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">150</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">450</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>E2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">180</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">540</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>pSB1C3</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">210</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">630</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">170</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">510</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">210</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">630</td>
 +
                          </tr>
 +
                      </tbody>
 +
                  </table>
 +
        <br/><br/><br/>
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
  <div class="lightbox" id="exp6">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher)</br>
 +
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                &bull; Nanodrop (Thermofisher)</br>
 +
                &bull; Elution buffer from QIAGEN kit</br>
 +
                &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>) <br/><br/>
 +
 +
              <U>Method:</U></br>
 +
              1. Analyze absorbance at 260nm</br>
 +
              2. Clean the Nanodrop with water</br>
 +
              3. Make the blank with 1&#956;l of elution buffer</br>
 +
              4. Put 1ul of your sample on the Nanodrop</br>
 +
              5. Make the measure and clean the Nanodrop between each measure</br></br>
 +
 +
              <U>Results:</U></br>
 +
 +
                  <table>
 +
                  <caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 147 :</U> Absorbance </p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Absorbance at 260 nm</th>
 +
                            <th>A260/280</th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;l)</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B2-col7</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.12</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">3.7</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B2-col9</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.19</td>
 +
                            <td>5.3</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B1-col6</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.04</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">3.2</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>B1-col8</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.98</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">3.7</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>C1</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.78 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">5.0</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>C2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.90 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">307.1</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>D2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.84 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">5.2</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>E1</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.30 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">3.9</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>E2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.17 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">3.8</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>pSB1C3</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.98</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">13.1</td>
 +
                          </tr>                     
 +
                            <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.11</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">4.8</td>
 +
                          </tr>                       
 +
                            <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">2.45</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">4.3</td>
 +
                          </tr>
 +
                        </tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
                  </br></br></br>
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
</body>
 +
</html>

Latest revision as of 03:52, 20 October 2016