Team:WashU StLouis/Experiments
Protocols
Check out the protocols we used for our project
Cloning
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- Centrifuge (X mL) cell culture for 15 minutes at 5000g
- Discard supernatant and resuspend in 1 mL of cloning water
- Transfer solution into bashing bead lysis/filtration tube
- Add 6 mL of fungal/bacterial DNA binding buffer
- Vortex for 5 minutes
- Spin down for 5 minutes at 5000g
- Transfer filter to a 50 mL tube
- Put spin column in collection tube and spin in a microcentrifuge for 1 minute at 10,000g
- Add 150 mL of DNA pre-wash buffer, spin for 1 minute at 10,000g, discard flow through, and repeat once
- Add 200 uL of fungal/bacterial DNA wash buffer to column, spin for 1 minute at 10,000g, and repeat 3 more times
- Transfer column to a 1.5 mL microcentrifuge tube and add 30 uL of cloning water
- Let sit for 4 minutes, then spin for 4 minutes at 10,000 g
- Measure concentration of gDNA and label tube
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- Add the following to a single PCR tube:
- 20-21.5 uL Cloning Water (depending on type of amplicon)
- 10 uL of Betaine
- 10 uL of 5x High-Fidelity Buffer
- 4 uL DMSO
- 2.5 uL 10 uM combined forward/reverse primers
- 1 uL DNTPs
- 0.5 uL of plasmid or 2 uL of gDNA
- 0.5 uL of Phusion Polymerase (kept on ice)
- Immediately run in a thermocycler for the following times/temperatures
- Initial Denaturation 98C 30 sec
- 25-35 cycles
- 98 C 5-10 sec
- 45-72 C (at annealing temp) 10-30 sec
- 72 C 15-30 sec/(length of amplicon in kb)
- Final Extension 72 C 5-10 minutes
- Hold at 4C
- Store at 4C until use
Our iGEM team shared lab space in two different labs. Because of this, we learned two different protocols for gel electrophoresis:
Making the Gel
- Measure 1 gram of Agarose per 100 mL TAE buffer (Tris base, acetic acid and EDTA)
- We generally made gels with 75 - X mL of TAE
- Microwave in a covered erlenmeyer flask for 120 seconds
- Add 1 uL of SYBR Safe per 20 mL of TAE
- Pour into gel casing
- Remove bubbles with a pipettor
- Insert well comb
- Allow to set (~20 minutes)
Running the Gel
- Remove well comb
- Place gel in electrophoresis apparatus with the wells by the cathode (black)
- Fill apparatus with TAE buffer so that the gel is completely submerged
- Load wells with 10-60 uL of 5 (PCR product): 1 (6x Loading Dye)
- Load 5-10(?) uL of ladder into first and last wells
- Run at 125(?) V and 25(?) amps for 30(?) minutes
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
BioBrick
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Measurement and Assays
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Miscellaneous
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipiscing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
Lorem ipsum dolor sit amet, consectetur adipisicing elit, sed do eiusmod tempor incididunt ut labore et dolore magna aliqua. Ut enim ad minim veniam, quis nostrud exercitation ullamco laboris nisi ut aliquip ex ea commodo consequat.
- step 1
- step 2
- step 3
