Difference between revisions of "Team:Ionis Paris/Protocol 7"

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         <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,600,700,600italic,400italic,700italic,300,300italic' rel='stylesheet' type='text/css'>
 
         <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,600,700,600italic,400italic,700italic,300,300italic' rel='stylesheet' type='text/css'>
  
−
        <!-- Nos feuilles de style -->
+
          <!-- Nos feuilles de style -->
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        <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-test?action=raw&ctype=text/css" />
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    <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-style-css-template?action=raw&ctype=text/css" />
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        <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-style-css?action=raw&ctype=text/css" />
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    <!-- Version minifiée dans le bon ordre de toutes les feuilles de style du template -->
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    <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-style-css?action=raw&ctype=text/css" />
 
          
 
          
 
        
 
        
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                     <div class="col-sm-12">
 
                     <div class="col-sm-12">
 
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                             <h1>Protocol 7</h1>
+
                             <h1 id="back_to_the_top">Protocol 7</h1>
 
                              
 
                              
 
                         </div>
 
                         </div>
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                               <h4 class="blog" style="margin-top:20px">
 
                               <h4 class="blog" style="margin-top:20px">
 
                                   PCR</h4>
 
                                   PCR</h4>
−
                                     <p>Prepare the following reaction in a 0,2 mL PCR tube :<br/>
+
                                     <p>Prepare the following reaction in a 0,2mL PCR tube :<br/>
−
                                     NB : All components must be vortexed before use
+
                                     <i>NB : All components must be vortexed before use</i>
 
                                     </p>
 
                                     </p>
−
                                          <figure class="postImg waves-effect">
+
                                       
−
                                    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/5/5a/IGEM_IONIS_-_protocol_7.png" alt="">
+
<table>
−
                                                  </figure>
+
<tr> <td> Component </td> <td> 50µL reaction </td> <td> Final concentration </td> </tr>
 +
<tr> <td> Nuclease-free water </td> <td> to 50µL </td> <td> </td> </tr>
 +
<tr> <td> 10X Standard Taq reaction Buffer </td> <td> 5µL </td> <td> 1X </td> </tr>
 +
<tr> <td> 10mM dNTPs </td> <td> 1µL </td> <td> 200µM</td> </tr>
 +
<tr> <td> 10µM Forward primer </td> <td> 1µL</td> <td> 0.2µM (0.05-1µM) </td> </tr>
 +
<tr> <td> 10µM Reverse primer  </td> <td> 1µL </td> <td> 0.2µM (0.05-1µM) </td> </tr>
 +
<tr> <td> Template DNA </td> <td> </td> <td> <1,000ng </td> </tr>
 +
<tr> <td> Taq polymerase </td> <td> 0.25µL </td> <td> 1.25 units </td> </tr>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
</table>
 
                                     <p>Gently mix the reaction and spin down microcentrifuge.<br/>
 
                                     <p>Gently mix the reaction and spin down microcentrifuge.<br/>
 
                                           Transfer PCR tubes from ice to a PCR machine with the block preheated to 95°C<br/>
 
                                           Transfer PCR tubes from ice to a PCR machine with the block preheated to 95°C<br/>
−
                                           Set the following parameters for the PCR reaction :<br/>
+
                                           Set the following parameters for the PCR reaction :<br/> </p>
−
- Lid température 95°C<br/>
+
<p>
−
- Initial denaturation : 95°C 30 s<br/>
+
<li> Lid température 95°C </li>  
−
- 25 cycles of : 95°C 30 s<br/>
+
<li>Initial denaturation : 95°C 30 s </li>
−
                                            58°C 60 s<br/>
+
<li>25 cycles of : <br/>
−
                                            68°C 1 min per kB to amplify<br/>
+
95°C 30 s <br/>
−
- Final extension : 68°C 5 min<br/>
+
Tm* 60 s<br/>
−
- Hold : 4°C<br/></p>
+
68°C 1 min per kB to amplify</li>
 +
<li>Final extension : 68°C 5 min</li>
 +
<li> Hold : 4°C</li></p>
 +
<p> *precise Tm for each primer </p>
  
 
                                 <h4 class="blog" style="margin-top:20px"> PCR purification</h4>
 
                                 <h4 class="blog" style="margin-top:20px"> PCR purification</h4>
−
                                     <p>Add 5 volumes Buffer PB to 1 volume of the PCR reaction and mix. If the color of the mixture is orange or violet, add 10 µL 3 M sodium acetate, pH 5.0, and mix. The color of the mixture will turn yellow.<br/>
+
                                     <p>Add 5 volumes Buffer PB to 1 volume of the PCR reaction and mix. If the color of the mixture is orange or violet, add 10µL 3 M sodium acetate, pH 5.0, and mix. The color of the mixture will turn yellow.<br/>
−
Place a QIAquick column in a provided 2 mL collection tube.<br/>
+
Place a QIAquick column in a provided 2mL collection tube.<br/>
 
To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column and centrifuge for 60 s. Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.<br/>
 
To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column and centrifuge for 60 s. Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.<br/>
−
To wash, add 0.75 mL Buffer PE to the QIAquick column, centrifuge for 60 s. Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.<br/>
+
To wash, add 0.75mL Buffer PE to the QIAquick column, centrifuge for 60 s. Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.<br/>
−
Centrifuge the QIAquick column once more in the provided 2 mL collection tube for 1 min to remove residual wash buffer.<br/>
+
Centrifuge the QIAquick column once more in the provided 2mL collection tube for 1 min to remove residual wash buffer.<br/>
 
Place each QIAquick column in a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.<br/>
 
Place each QIAquick column in a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.<br/>
−
To elute DNA, add 30 µL Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) elution buffer to the center of the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min at 13000 rpm.</p>  
+
To elute DNA, add 30µL Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) elution buffer to the center of the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min at 13000 rpm.</p>  
  
 
                                 </div>
 
                                 </div>
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                                     </li>
 
                                     </li>
 
                                       <li>
 
                                       <li>
−
                                         <span>Template DNA (1-2µg)</span>
+
                                         <span>Template DNA (1µg)</span>
 
                                         </a>
 
                                         </a>
 
                                     </li>
 
                                     </li>
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                                 </ul>
 
                                 </ul>
 +
</aside>
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                           <h4 class="sidebar_Hd">Sources</h4>   
 
                           <h4 class="sidebar_Hd">Sources</h4>   
−
<li><p><a href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202?device=pdf">NEB - Ligation Protocol with T4 DNA Ligase</a></p></li>
+
<li><p><a href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/dna-ligation-with-t4-dna-ligase-m0202?device=pdf"><font color="DeepPink">NEB - Ligation Protocol with T4 DNA Ligase</font></a></p></li>
  
−
<li><p><a href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/protocols/nucleic-acid-amplification-and-expression-profiling/pcr-protocol/accuprime-pfx-dna-polymerase.html">ThermoFisher - AccuPrime™ Pfx DNA Polymerase</a></p></li>
+
<li><p><a href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/protocols/nucleic-acid-amplification-and-expression-profiling/pcr-protocol/accuprime-pfx-dna-polymerase.html"><font color="DeepPink">ThermoFisher - AccuPrime™ Pfx DNA Polymerase</font></a></p></li>
  
−
<li><p><a href="https://www.qiagen.com/fi/resources/resourcedetail?id=390a728a-e6fc-43f7-bf59-b12091cc4380&lang=en">Qiagen - QIAquick PCR Purification Kit</a></p></li>
+
<li><p><a href="https://www.qiagen.com/fi/resources/resourcedetail?id=390a728a-e6fc-43f7-bf59-b12091cc4380&lang=en"><font color="DeepPink">Qiagen - QIAquick PCR Purification Kit</font></a></p></li>
  
−
                         </aside>
+
                          
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
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         <!-- ====END BLOG TABLE==== -->
 
         <!-- ====END BLOG TABLE==== -->
 
          
 
          
−
        <!-- ====START SOCIAL Link==== -->
+
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        <div class="footer_social">
+
    <!-- ====START SOCIAL Link==== -->
−
            <div class="container-fluid">
+
    <div class="footer_social">
−
                <div class="row">
+
        <div class="container-fluid">
−
                    <ul class="ft_top clearfix">
+
            <div class="row">
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
                <ul class="ft_top clearfix">
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                            <a href="#" target="_blank">
+
                    <li class="waves-effect waves-light">
−
                                <i class="zmdi zmdi-facebook "></i>Facebook
+
                        <a href="https://www.facebook.com/ionisigem/?fref=ts" target="_blank">
−
                            </a>
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                            <i class="zmdi zmdi-facebook "></i>Facebook
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                        </li>  
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                        <li class="waves-effect waves-light">
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                    </li>
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                            <a href="#" target="_blank">
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                    <li class="waves-effect waves-light">
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                                <i class="zmdi zmdi-twitter"></i>Twitter
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                        <a href="https://twitter.com/igem_ionis" target="_blank">
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                            </a>
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                            <i class="zmdi zmdi-twitter"></i>Twitter
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                        </li>  
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                        </a>
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                        <li class="waves-effect waves-light">
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                    </li>
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                            <a href="#" target="_blank">
+
                    <li class="waves-effect waves-light">
−
                                <i class="zmdi zmdi-flickr"></i>Flickr
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                        <a href="https://www.youtube.com/channel/UC0RyQsB5YpweSRBYQlAdZDA" target="_blank">
−
                            </a>
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                            <i class="zmdi zmdi-youtube"></i>youtube
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                        </li>
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                        </a>
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                        <li class="waves-effect waves-light">
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                    </li>
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                            <a href="#" target="_blank">
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                    <li class="waves-effect waves-light">
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                                <i class="zmdi zmdi-linkedin"></i>LinkedIn
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                        <a href="https://www.linkedin.com/company/igem-ionis" target="_blank">
−
                            </a>
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                            <i class="zmdi zmdi-linkedin"></i>LinkedIn
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                        </li>  
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                        </a>
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                        <li class="waves-effect waves-light">
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                            <a href="#" target="_blank">
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                                <i class="zmdi zmdi-dribbble"></i>Dribble
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                 </ul>
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                            <a href="#" target="_blank">
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                                <i class="zmdi zmdi-vimeo"></i>Vimeo
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        <!-- ====END FOOTER TOP==== -->
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    </div>
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    <!-- ====END FOOTER TOP==== -->
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        <!-- ====START FOOTER AREA==== -->
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        <footer class="footer_area">
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    <!-- ====START FOOTER AREA==== -->
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            <div class="footer_middle">
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    <footer class="footer_area">
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                <div class="container">
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        <div class="footer_middle">
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                            <div class="sroll_top">
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                                <a href="#ancre"> <i class="zmdi zmdi-chevron-up btn waves-effect"> </i> </a>
 
                             </div>
 
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                         </div>
 
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                <div class="row">
 
                     <div class="row">
 
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                         <div class="col-lg-5 col-md-5 col-sm-12">
 
                         <div class="col-lg-5 col-md-5 col-sm-12">
 
                             <div class="middle_content">
 
                             <div class="middle_content">
−
                                 <h4>More about us</h4>
+
                                 <h4>iGEM IONIS</h4>
−
                                 <p>If you’ve followed along and done the steps above, you’ve created a good starting place. You’re going to need to make sure your pages are optimized properly. This will ensure you get your page ranked high in the search engines. ou’re going to need to make sure your pages are optimized properly.
+
                                 <p> We're a group of six different schools from the IONIS Education Group. For this
−
            Read More</p>
+
                                    competition we wanted to take advantages of the multiple schools and activity field
−
                              <a href="#">Read More</a>
+
                                    given by the IONIS education group to create a solid project.</p>
 +
                                <a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Team">Read More</a>
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                         </div>
 
                         </div>
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                         <div class="col-lg-3 col-lg-offset-1 col-md-4 col-sm-7">
 
                         <div class="col-lg-3 col-lg-offset-1 col-md-4 col-sm-7">
 
                             <div class="footer_Widgets">
 
                             <div class="footer_Widgets">
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                                     <ul>
 
                                     <ul>
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-pin"></i>
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-pin"></i>
−
                                             <span>Location: Lorance Road 542B,5248 MT, Wordwide Country</span>
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                                             <span>Location: 66 Rue Guy Môquet, 94800 Villejuif, France</span>
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                                        </li>
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                                        <li><i class="zmdi zmdi-phone"></i>
+
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                                            <a href="tel:123-456-7890">Phone: 123-456-7890</a>
+
 
                                         </li>
 
                                         </li>
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                                         <li><i class="zmdi zmdi-email"></i>
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-email"></i>
−
                                             <a href="mailto:contact@domain.com">email: contact@domain.com</a>
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                                             <a href="mailto:igem.ionis@gmail.com">email: igem.ionis@gmail.com</a>
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                                        </li>
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                                        <li><i class="zmdi zmdi-globe"></i>
+
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                                            <a href="#">www.domain.com</a>
+
 
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                                         <li><a href="#">Home</a></li>
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                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris">Home</a></li>
−
                                         <li><a href="#">Services</a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Working_at_La_Paillasse">in the Lab</a></li>
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                                         <li><a href="#"> About </a></li>
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                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Measurement"> Side Projects</a></li>
−
                                         <li><a href="#">Portfolio</a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Parts">Results</a></li>
−
                                         <li><a href="#">Blog </a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/HPintro">Human
−
                                         <li><a href="#">Contact US</a></li>
+
                                            Practice</a></li>
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                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Team">Team</a></li>
 
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                                     <p>©2016 Design by <a href="https://www.behance.net/googoling">Faridul Haque</a> and Develop by <a href="http://themeebit.com">ThemeeBiT</a>.</p>  
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                                     <p>©IONIS_IGEM_2016</a>.</p>
 
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Latest revision as of 19:52, 19 October 2016

Protocol 7 : PCR and PCR purification

Aim: DNA fragment amplification and purification

PCR

Prepare the following reaction in a 0,2mL PCR tube :
NB : All components must be vortexed before use

Component 50µL reaction Final concentration
Nuclease-free water to 50µL
10X Standard Taq reaction Buffer 5µL 1X
10mM dNTPs 1µL 200µM
10µM Forward primer 1µL 0.2µM (0.05-1µM)
10µM Reverse primer 1µL 0.2µM (0.05-1µM)
Template DNA <1,000ng
Taq polymerase 0.25µL 1.25 units

Gently mix the reaction and spin down microcentrifuge.
Transfer PCR tubes from ice to a PCR machine with the block preheated to 95°C
Set the following parameters for the PCR reaction :

  • Lid température 95°C
  • Initial denaturation : 95°C 30 s
  • 25 cycles of :
    95°C 30 s
    Tm* 60 s
    68°C 1 min per kB to amplify
  • Final extension : 68°C 5 min
  • Hold : 4°C

    • *precise Tm for each primer

    PCR purification

    Add 5 volumes Buffer PB to 1 volume of the PCR reaction and mix. If the color of the mixture is orange or violet, add 10µL 3 M sodium acetate, pH 5.0, and mix. The color of the mixture will turn yellow.
    Place a QIAquick column in a provided 2mL collection tube.
    To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column and centrifuge for 60 s. Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.
    To wash, add 0.75mL Buffer PE to the QIAquick column, centrifuge for 60 s. Discard flow-through and place the QIAquick column back in the same tube.
    Centrifuge the QIAquick column once more in the provided 2mL collection tube for 1 min to remove residual wash buffer.
    Place each QIAquick column in a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.
    To elute DNA, add 30µL Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) elution buffer to the center of the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min at 13000 rpm.

    Sources

  • NEB - Ligation Protocol with T4 DNA Ligase

  • ThermoFisher - AccuPrime™ Pfx DNA Polymerase

  • Qiagen - QIAquick PCR Purification Kit