Difference between revisions of "Team:Ionis Paris/Protocol 13"

(Created page with "{{IONIS_HEADER}} <html> <!-- ====Google font==== --> <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Merriweather:400,700,700italic,400italic,300italic...")
 
 
(10 intermediate revisions by 4 users not shown)
Line 7: Line 7:
 
         <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,600,700,600italic,400italic,700italic,300,300italic' rel='stylesheet' type='text/css'>
 
         <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,600,700,600italic,400italic,700italic,300,300italic' rel='stylesheet' type='text/css'>
  
−
        <!-- Nos feuilles de style -->
+
    <!-- Nos feuilles de style -->
−
        <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-test?action=raw&ctype=text/css" />
+
    <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-style-css-template?action=raw&ctype=text/css" />
−
        <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-style-css?action=raw&ctype=text/css" />
+
    <link rel="stylesheet" type="text/css" href="https://2016.igem.org/Template:IONIS_Paris-style-css?action=raw&ctype=text/css" />
−
       
+
 
        
 
        
 
         <!-- ====BREADCUM START==== -->  
 
         <!-- ====BREADCUM START==== -->  
Line 18: Line 17:
 
                     <div class="col-sm-12">
 
                     <div class="col-sm-12">
 
                         <div class="banner_title" >
 
                         <div class="banner_title" >
−
                             <h1>Protocol 13</h1>
+
                             <h1 id="back_to_the_top">Protocol 13</h1>
 
                              
 
                              
 
                         </div>
 
                         </div>
Line 48: Line 47:
 
                                  
 
                                  
 
                                       <div class="blog_top">
 
                                       <div class="blog_top">
−
                                 <p><b>Warning: in order to get proper result analysis, it is better to perform 3 replicates for each toluene concentration</b></p>
+
                                 <p><i>3 replicates for each toluene concentration were realized in order to improve the results statistics</i></p>
 +
<p><b> Every toluene manipulations were performed under a chemical hood and following the safety protocol available <a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Labsafety" ><font color="DeepPink"> here </font></a>. Bacterial culture containing toluene were only openned under the chemical hood. Spectrometer tank as well as 96 wells plate were covered with parafilm before proceeded to OD or luciferase activity measurement.</b></p>
 +
 
 
                               <h4 class="blog" style="margin-top:20px">
 
                               <h4 class="blog" style="margin-top:20px">
 
                                     Toluene preparation: stock solutions</h4>
 
                                     Toluene preparation: stock solutions</h4>
−
                                    <p><b><u>100mg/L:</u></b> Dilution of absolute liquid toluene to obtain a final toluene concentration at 100mg/L: Add 11,53uL of toluene into 100mL water (calculations done from toluene's molecular weight)<br/><b><u>100µg/L:</u></b> Dilute 10µL of the first stock solution into 10mL of water</p>
+
 
 +
<p>
 +
<b><u>1g/L:</u></b> Dilution of absolute liquid toluene to obtain a final toluene concentration at 1g/L: Add 11,53µL of toluene into 10mL water (calculations done from toluene's molecular weight) <br/>
 +
 
 +
<b><u>100mg/L:</u></b> Dilute 1mL of the toluene stock solution at 1g/L into 9mL of water<br/>
 +
 
 +
<b><u>100µg/L:</u></b> Dilute 10µL of the toluene stock solution at 100mg/L into 10mL of water</p>
  
 
                               <h4 class="blog" style="margin-top:20px">
 
                               <h4 class="blog" style="margin-top:20px">
 
                                     Inoculation</h4>
 
                                     Inoculation</h4>
−
                                 <p>From 1 UFC:<br./>
+
                                 <p>From 1 UFC:<br/>
−
Resuspend colony in 20 mL of LB medium containing chloramphenicol at 25µg/mL but free of toluene and grow over night.<br/>
+
Resuspend a colony in 20mL of LB medium containing chloramphenicol at 25µg/mL but free of toluene and grow over night.<br/>
 
When turbidity is high, inoculate the appropriate volume of bacteria culture to liquid LB medium containing chloramphenicol to reach 0,1 OD in the flask (100mL). Incubate culture at 37°C and 250 rpm .<br/>
 
When turbidity is high, inoculate the appropriate volume of bacteria culture to liquid LB medium containing chloramphenicol to reach 0,1 OD in the flask (100mL). Incubate culture at 37°C and 250 rpm .<br/>
−
When the OD reach 0.3, separate the initial bacterial culture to several falcon tubes (5mL in each tube) and add toluene to reach the desired toluene concentration. </p>
+
When the OD reach 0.3, separate the initial bacterial culture into several falcon tubes (10mL in each tube) and add toluene to reach the desired toluene concentration. </p>
  
−
                                <figure class="postImg waves-effect">
+
<table>
−
                                    <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/b/b4/T--Ionis_Paris--Protocol12Table1.png" alt="">
+
−
                                </figure>
+
−
                                <p>Incubate culture at 37°C and 250 rpm.<br/>
+
−
Prepare the GLuc assay solution (e.g. 100 samples) by adding 50 μl of BioLux GLuc Substrate to 5 ml of BioLux GLuc Assay Buffer immediately before performing the assay. Mix well by inverting the tube several times (Do not vortex). Set the camera.<br/>
+
−
At several time (t= 30min, t=1h, t=1h30…, t=4h), pipet samples (5–20 μl per well) into a 96-well white (opaque) or black plate, or a luminometer tube. <br/>
+
−
Add the GLuc assay solution (50 μl) to a sample (i.e. Add the assay solution to only one sample at a time) and promptly measure the luminescence. <br/>
+
−
<b>NB : Approximately 90% of GLuc is secreted out into the growth media after transfection and thus, the GLuc activity is typically assayed from the supernatant (i.e. growth media of GLuc-transfected cells). However, as long as the cells are alive, approximately 10% of GLuc is present inside the cells. Therefore, GLuc activity can also be assayed from the cell lysate. </b></p>
+
  
−
<iframe width="560" height="315" src="https://www.youtube.com/embed/G0SF4aWuL4E" frameborder="0" allowfullscreen></iframe>
+
<tr>
 +
<td> </td>
 +
<td> C0 Control </td>
 +
<td> C1 </td>
 +
<td> C2 </td>  
 +
</tr>
  
 +
<tr>
 +
<td>  Bacterial culture (mL) </td>
 +
<td> 10 </td>
 +
<td> 10 </td>
 +
<td> 10 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Toluene from stock solution 100µg/L (µL) </td>
 +
<td> 0 </td>
 +
<td> 1 </1td>
 +
<td> 10 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Obtain concentration </td>
 +
<td> 0 </td>
 +
<td> 10ng/L </td>
 +
<td> 100ng/L </td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
 +
<table>
 +
<tr>
 +
<td> </td>
 +
<td> C3 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Bacterial culture  (mL) </td>
 +
<td> 10 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Toluene from stock solution 100mg/L (µL)  </td>
 +
<td> 1 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Obtain concentration </td>
 +
<td> 10µg/L </td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
 +
<table>
 +
<tr>
 +
<td> </td>
 +
<td> C4 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Bacterial culture (mL) </td>
 +
<td> 10 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Toluene from stock solution 1g/L (µL) </td>
 +
<td> 100 </td>
 +
</tr>
 +
 +
<tr>
 +
<td> Obtain concentration </td>
 +
<td> 10mg/L </td>
 +
</tr>
 +
</table>
 +
 +
 +
 +
                                <p>Incubate culture at 37°C and 250 rpm.<br/>
 +
Prepare the GLuc assay solution (e.g. 100 samples) by adding 50µL of BioLux GLuc Substrate to 5mL of BioLux GLuc Assay Buffer immediately before performing the assay. Mix well by inverting the tube several times (Do not vortex). Set the camera.<br/>
 +
At several time (t=1h, t=3h…,t=4h30, t=5h30), pipet samples (20µL per well) into a 96-well white (opaque) or black plate, or a luminometer tube. <br/>
 +
Add 50µL of GLuc assay solution to a sample (i.e. Add the assay solution to only one sample at a time) and promptly measure the luminescence. <br/>
 +
Measure bacterial culture OD <br/>
 +
<i>NB : Approximately 90% of GLuc is secreted out into the growth media after transfection and thus, the GLuc activity is typically assayed from the supernatant (i.e. growth media of GLuc-transfected cells). However, as long as the cells are alive, approximately 10% of GLuc is present inside the cells. Therefore, GLuc activity can also be assayed from the cell lysate. </i></p>
  
  
Line 176: Line 255:
 
                                     <li>
 
                                     <li>
 
                                         <a href="Protocol 12">
 
                                         <a href="Protocol 12">
−
                                             <span>Protocol 12 : Bacterial growth analysis</span>
+
                                             <span>Protocol 12 : Cell survival assay</span>
 
                                            
 
                                            
 
                                         </a>
 
                                         </a>
Line 217: Line 296:
 
                                     </li>
 
                                     </li>
 
                                     <li>
 
                                     <li>
−
                                         <span>Toluene</span>
+
                                      <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/244511?lang=fr&region=FR">
 +
                                         <span>Toluene (244511 SIGMA-ALDRICH)</span>
 +
                                    </a>
 
                                     </li>
 
                                     </li>
 
<li>
 
<li>
Line 238: Line 319:
 
                                             <span>Spectrophotometer</span>
 
                                             <span>Spectrophotometer</span>
 
                                     </li>
 
                                     </li>
 +
                                  <li>
 +
                                            <a href="https://www.berthold.com/en/bio/monochromator_multilabel_microplate_reader_Mithras2_LB943">
 +
                                            <span>Luminometer</span>
 +
                                            </a>
 +
                                    </li>
 +
 
                              
 
                              
 
                                 </ul>
 
                                 </ul>
 +
</aside>
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                             <h4 class="sidebar_Hd">Sources</h4>
 
                             <h4 class="sidebar_Hd">Sources</h4>
−
               <p><li><a href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/protocol-i-luminometers-without-injectors-e3300">NEB Standard luminescence assay protocols</a></li></p>
+
               <p><li><a href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/protocol-i-luminometers-without-injectors-e3300"><font color="DeepPink">NEB Standard luminescence assay protocols</font></a></li></p>
−
                         </aside>
+
                          
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
Line 250: Line 338:
 
         <!-- ====END BLOG TABLE==== -->
 
         <!-- ====END BLOG TABLE==== -->
 
          
 
          
−
        <!-- ====START SOCIAL Link==== -->
+
      <!-- ====START SOCIAL Link==== -->
−
        <div class="footer_social">
+
    <div class="footer_social">
−
            <div class="container-fluid">
+
        <div class="container-fluid">
−
                <div class="row">
+
            <div class="row">
−
                    <ul class="ft_top clearfix">
+
                <ul class="ft_top clearfix">
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
                    <li class="waves-effect waves-light">
−
                            <a href="#" target="_blank">
+
                        <a href="https://www.facebook.com/ionisigem/?fref=ts" target="_blank">
−
                                <i class="zmdi zmdi-facebook "></i>Facebook
+
                            <i class="zmdi zmdi-facebook "></i>Facebook
−
                            </a>
+
                        </a>
−
                        </li>  
+
                    </li>
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
                    <li class="waves-effect waves-light">
−
                            <a href="#" target="_blank">
+
                        <a href="https://twitter.com/igem_ionis" target="_blank">
−
                                <i class="zmdi zmdi-twitter"></i>Twitter
+
                            <i class="zmdi zmdi-twitter"></i>Twitter
−
                            </a>
+
                        </a>
−
                        </li>  
+
                    </li>
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
                    <li class="waves-effect waves-light">
−
                            <a href="#" target="_blank">
+
                        <a href="https://www.youtube.com/channel/UC0RyQsB5YpweSRBYQlAdZDA" target="_blank">
−
                                <i class="zmdi zmdi-flickr"></i>Flickr
+
                            <i class="zmdi zmdi-youtube"></i>youtube
−
                            </a>
+
                        </a>
−
                        </li>
+
                    </li>
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
                    <li class="waves-effect waves-light">
−
                            <a href="#" target="_blank">
+
                        <a href="https://www.linkedin.com/company/igem-ionis" target="_blank">
−
                                <i class="zmdi zmdi-linkedin"></i>LinkedIn
+
                            <i class="zmdi zmdi-linkedin"></i>LinkedIn
−
                            </a>
+
                        </a>
−
                        </li>  
+
                    </li>
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
 
−
                            <a href="#" target="_blank">
+
                 </ul>
−
                                <i class="zmdi zmdi-dribbble"></i>Dribble
+
−
                            </a>
+
−
                        </li>
+
−
                        <li class="waves-effect waves-light">
+
−
                            <a href="#" target="_blank">
+
−
                                <i class="zmdi zmdi-vimeo"></i>Vimeo
+
−
                            </a>
+
−
                        </li>  
+
−
                    </ul>
+
−
                 </div>
+
 
             </div>
 
             </div>
 
         </div>
 
         </div>
−
        <!-- ====END FOOTER TOP==== -->
+
    </div>
−
       
+
    <!-- ====END FOOTER TOP==== -->
−
        <!-- ====START FOOTER AREA==== -->
+
 
−
        <footer class="footer_area">
+
    <!-- ====START FOOTER AREA==== -->
−
            <div class="footer_middle">
+
    <footer class="footer_area">
−
                <div class="container">
+
        <div class="footer_middle">
−
                    <div class="row">
+
            <div class="container">
−
                        <div class="col-xs-12">
+
                <div class="row">
−
                            <div class="scroll_area">
+
                    <div class="col-xs-12">
 +
                        <div class="scroll_area">
 +
                            <div class="sroll_top">
 +
                                <a href="#ancre"> <i class="zmdi zmdi-chevron-up btn waves-effect"> </i> </a>
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                     </div>
 
                     </div>
 +
                </div>
 +
                <div class="row">
 
                     <div class="row">
 
                     <div class="row">
 
                         <div class="col-lg-5 col-md-5 col-sm-12">
 
                         <div class="col-lg-5 col-md-5 col-sm-12">
 
                             <div class="middle_content">
 
                             <div class="middle_content">
−
                                 <h4>More about us</h4>
+
                                 <h4>iGEM IONIS</h4>
−
                                 <p>If you’ve followed along and done the steps above, you’ve created a good starting place. You’re going to need to make sure your pages are optimized properly. This will ensure you get your page ranked high in the search engines. ou’re going to need to make sure your pages are optimized properly.
+
                                 <p> We're a group of six different schools from the IONIS Education Group. For this
−
            Read More</p>
+
                                    competition we wanted to take advantages of the multiple schools and activity field
−
                              <a href="#">Read More</a>
+
                                    given by the IONIS education group to create a solid project.</p>
 +
                                <a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Team">Read More</a>
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                         </div>
 
                         </div>
 +
 
                         <div class="col-lg-3 col-lg-offset-1 col-md-4 col-sm-7">
 
                         <div class="col-lg-3 col-lg-offset-1 col-md-4 col-sm-7">
 
                             <div class="footer_Widgets">
 
                             <div class="footer_Widgets">
Line 316: Line 401:
 
                                     <ul>
 
                                     <ul>
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-pin"></i>
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-pin"></i>
−
                                             <span>Location: Lorance Road 542B,5248 MT, Wordwide Country</span>
+
                                             <span>Location: 66 Rue Guy Môquet, 94800 Villejuif, France</span>
−
                                        </li>
+
−
                                        <li><i class="zmdi zmdi-phone"></i>
+
−
                                            <a href="tel:123-456-7890">Phone: 123-456-7890</a>
+
 
                                         </li>
 
                                         </li>
 +
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-email"></i>
 
                                         <li><i class="zmdi zmdi-email"></i>
−
                                             <a href="mailto:contact@domain.com">email: contact@domain.com</a>
+
                                             <a href="mailto:igem.ionis@gmail.com">email: igem.ionis@gmail.com</a>
−
                                        </li>
+
−
                                        <li><i class="zmdi zmdi-globe"></i>
+
−
                                            <a href="#">www.domain.com</a>
+
 
                                         </li>
 
                                         </li>
 +
 
                                     </ul>
 
                                     </ul>
 
                                 </div>
 
                                 </div>
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                         </div>
 
                         </div>
−
                        <div class="col-lg-3 col-md-3 col-sm-5">
+
                    <div class="col-lg-3 col-md-3 col-sm-5">
 
                             <div class="footer_Widgets">
 
                             <div class="footer_Widgets">
−
                                 <h4>Galleries</h4>
+
                                 <h4>Download the app</h4>
−
                                 <figure class="widget_gallery">
+
                                 <a href="https://itunes.apple.com/us/app/quantifly/id1166875690?ls=1&mt=8"
−
                                    <div class="RXcircleEffect"></div>
+
                                  target="_blank" style="target-new: tab;">
−
                                    <img src="img/gallery_1.jpg" alt="" />
+
                                    <figure class="widget_gallery">
−
                                    <figcaption>
+
                                        <div class="RXcircleEffect"></div>
−
                                         <a class="veno vbox-item" href="img/gallery_1.jpg" data-gall="group_4">
+
                                        <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/8/8d/IONIS_IGEM_paris_logo_apple.png"
 +
                                            alt="" />
 +
                                         <figcaption>
 
                                             <i class="zmdi zmdi-link"></i>
 
                                             <i class="zmdi zmdi-link"></i>
−
                                         </a>
+
                                         </figcaption>
−
                                     </figcaption>
+
                                     </figure>
−
                                 </figure>
+
                                 </a>
−
                                 <figure class="widget_gallery">
+
                                 <a href="https://play.google.com/store/apps/details?id=fr.plnech.quantifly&hl=en"
−
                                    <div class="RXcircleEffect"></div>
+
                                  target="_blank" style="target-new: tab;">
−
                                    <img src="img/gallery_2.jpg" alt="" />
+
                                    <figure class="widget_gallery">
−
                                    <figcaption>
+
                                        <div class="RXcircleEffect"></div>
−
                                         <a class="veno vbox-item" href="img/gallery_2.jpg" data-gall="group_4">
+
                                        <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/65/IONIS_IGEM_paris_google_play.png"
 +
                                            alt="" />
 +
                                         <figcaption>
 
                                             <i class="zmdi zmdi-link"></i>
 
                                             <i class="zmdi zmdi-link"></i>
−
                                         </a>
+
                                         </figcaption>
−
                                    </figcaption>
+
                                     </figure>
−
                                </figure>
+
                                 </a>
−
                                <figure class="widget_gallery">
+
 
−
                                     <div class="RXcircleEffect"></div>
+
                       
−
                                    <img src="img/gallery_3.jpg" alt="" />
+
−
                                    <figcaption>
+
−
                                        <a class="veno vbox-item" href="img/gallery_3.jpg" data-gall="group_4">
+
−
                                            <i class="zmdi zmdi-link"></i>
+
−
                                        </a>
+
−
                                    </figcaption>
+
−
                                </figure>
+
−
                                 <figure class="widget_gallery">
+
−
                                    <div class="RXcircleEffect"></div>
+
−
                                    <img src="img/gallery_4.jpg" alt="" />
+
−
                                    <figcaption>
+
−
                                        <a class="veno vbox-item" href="img/gallery_4.jpg" data-gall="group_4">
+
−
                                            <i class="zmdi zmdi-link"></i>
+
−
                                        </a>
+
−
                                    </figcaption>
+
−
                                </figure>
+
−
                                <figure class="widget_gallery">
+
−
                                    <div class="RXcircleEffect"></div>
+
−
                                    <img src="img/gallery_5.jpg" alt="" />
+
−
                                    <figcaption>
+
−
                                        <a class="veno vbox-item" href="img/gallery_5.jpg" data-gall="group_4">
+
−
                                            <i class="zmdi zmdi-link"></i>
+
−
                                        </a>
+
−
                                    </figcaption>
+
−
                                </figure>
+
−
                                <figure class="widget_gallery">
+
−
                                    <div class="RXcircleEffect"></div>
+
−
                                    <img src="img/gallery_6.jpg" alt="" />
+
−
                                    <figcaption>
+
−
                                        <a class="veno vbox-item" href="img/gallery_6.jpg" data-gall="group_4">
+
−
                                            <i class="zmdi zmdi-link"></i>
+
−
                                        </a>
+
−
                                    </figcaption>
+
−
                                </figure>
+
 
                             </div>
 
                             </div>
 
                         </div>  
 
                         </div>  
 +
 
                     </div>
 
                     </div>
 +
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </div>
 
             </div>
Line 399: Line 452:
 
                             <div class="col-md-7 fix_p_l">
 
                             <div class="col-md-7 fix_p_l">
 
                                 <nav>
 
                                 <nav>
−
                                     <ul class="ft_bottom">    
+
                                     <ul class="ft_bottom">
−
                                         <li><a href="#">Home</a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris">Home</a></li>
−
                                         <li><a href="#">Services</a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Working_at_La_Paillasse">in the Lab</a></li>
−
                                         <li><a href="#"> About </a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Measurement"> Side Projects</a></li>
−
                                         <li><a href="#">Portfolio</a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Parts">Results</a></li>
−
                                         <li><a href="#">Blog </a></li>
+
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/HPintro">Human
−
                                         <li><a href="#">Contact US</a></li>
+
                                            Practice</a></li>
 +
                                         <li><a href="https://2016.igem.org/Team:Ionis_Paris/Team">Team</a></li>
 
                                     </ul>
 
                                     </ul>
 
                                 </nav>
 
                                 </nav>
Line 411: Line 465:
 
                             <div class="col-md-5 fix_p">
 
                             <div class="col-md-5 fix_p">
 
                                 <div class="ft_paragraph">
 
                                 <div class="ft_paragraph">
−
                                     <p>©2016 Design by <a href="https://www.behance.net/googoling">Faridul Haque</a> and Develop by <a href="http://themeebit.com">ThemeeBiT</a>.</p>  
+
                                     <p>©IONIS_IGEM_2016</a>.</p>
 
                                 </div>
 
                                 </div>
−
                             </div>
+
                             </div>
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
−
             </div>            
+
             </div>
−
        </footer>
+
    </footer>
−
        <!-- ====END FOOTER AREA==== -->
+
    <!-- ====END FOOTER AREA==== -->
−
       
+
 
−
     
+
    <!-- ====Google Maps API==== -->
−
        <!-- Nos scripts -->
+
    <script src="https://maps.googleapis.com/maps/api/js"></script>
−
        <script type="text/javascript" src="https://2016.igem.org/wiki/index.php?title=Template:IONIS_PARIS_JS&action=raw&ctype=text/javascript"></script>
+
 
−
     
+
    <!-- Nos scripts -->
 +
    <script type="text/javascript" src="https://2016.igem.org/wiki/index.php?title=Template:IONIS_PARIS_JS&action=raw&ctype=text/javascript"></script>
 +
 
 
</html>
 
</html>

Latest revision as of 19:55, 19 October 2016

Protocol 13: Luciferase assay

Aim: Assess the luminescence of our biosensor when exposed to toluene

3 replicates for each toluene concentration were realized in order to improve the results statistics

Every toluene manipulations were performed under a chemical hood and following the safety protocol available here . Bacterial culture containing toluene were only openned under the chemical hood. Spectrometer tank as well as 96 wells plate were covered with parafilm before proceeded to OD or luciferase activity measurement.

Toluene preparation: stock solutions

1g/L: Dilution of absolute liquid toluene to obtain a final toluene concentration at 1g/L: Add 11,53µL of toluene into 10mL water (calculations done from toluene's molecular weight)
100mg/L: Dilute 1mL of the toluene stock solution at 1g/L into 9mL of water
100µg/L: Dilute 10µL of the toluene stock solution at 100mg/L into 10mL of water

Inoculation

From 1 UFC:
Resuspend a colony in 20mL of LB medium containing chloramphenicol at 25µg/mL but free of toluene and grow over night.
When turbidity is high, inoculate the appropriate volume of bacteria culture to liquid LB medium containing chloramphenicol to reach 0,1 OD in the flask (100mL). Incubate culture at 37°C and 250 rpm .
When the OD reach 0.3, separate the initial bacterial culture into several falcon tubes (10mL in each tube) and add toluene to reach the desired toluene concentration.

C0 Control C1 C2
Bacterial culture (mL) 10 10 10
Toluene from stock solution 100µg/L (µL) 0 1 10
Obtain concentration 0 10ng/L 100ng/L
C3
Bacterial culture (mL) 10
Toluene from stock solution 100mg/L (µL) 1
Obtain concentration 10µg/L
C4
Bacterial culture (mL) 10
Toluene from stock solution 1g/L (µL) 100
Obtain concentration 10mg/L

Incubate culture at 37°C and 250 rpm.
Prepare the GLuc assay solution (e.g. 100 samples) by adding 50µL of BioLux GLuc Substrate to 5mL of BioLux GLuc Assay Buffer immediately before performing the assay. Mix well by inverting the tube several times (Do not vortex). Set the camera.
At several time (t=1h, t=3h…,t=4h30, t=5h30), pipet samples (20µL per well) into a 96-well white (opaque) or black plate, or a luminometer tube.
Add 50µL of GLuc assay solution to a sample (i.e. Add the assay solution to only one sample at a time) and promptly measure the luminescence.
Measure bacterial culture OD
NB : Approximately 90% of GLuc is secreted out into the growth media after transfection and thus, the GLuc activity is typically assayed from the supernatant (i.e. growth media of GLuc-transfected cells). However, as long as the cells are alive, approximately 10% of GLuc is present inside the cells. Therefore, GLuc activity can also be assayed from the cell lysate.

Sources

  • NEB Standard luminescence assay protocols