Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week9"

 
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</style>
 
</style>
 +
 +
  
 
<body>
 
<body>
  
−
  <div>
+
<div>
  
 
   <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><h2><B>Microbiology Notebook</B></h2><a/>  
 
   <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><h2><B>Microbiology Notebook</B></h2><a/>  
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</div>
 
</div>
  
−
 
+
  <div id="week9">
−
<div id="week13">
+
<p><h5><B>Week 9 </B></h3></p>
−
    <p><h5><B>Week 5</B></h5></p>
+
     <p><h3><B> August 1, 2016:</B></h3></p>
−
     <p><h3><B>August 29, 2016:</B></h3></p>
+
 
     <p>
 
     <p>
−
         <a href="#exp1"><h4>Measure the amount of DNA extracted from the miniprep</h4></a></br>  
+
         <a href="#exp1"><h4> 120. Silification tests </h4></a><br/>  
−
  </p>
+
        <a href="#exp2"><h4> 121. PCR of C1 v2 and C2 v2 with Takara enzyme </h4></a><br/>  
−
    <p><h3><B>September 1, 2016:</B></h3></p>
+
        <a href="#exp3"><h4> 122. Agarose gel </h4></a><br/>  
−
    <p>
+
         <a href="#exp4"><h4> 123. Electrophoresis of the PCR products (C1 v2 and C2 v2) </h4></a><br/>
−
         <a href="#exp2"><h4>Harvest the culture with Midiprep</h4></a></br>  
+
        <a href="#exp5"><h4> 124. PCR Clean up </h4></a><br/>
 
     </p>
 
     </p>
−
     <p><h3><B>September 2, 2016:</B></h3></p>
+
     <p><h3><B> August 2, 2016:</B></h3></p>
 
     <p>
 
     <p>
−
          <a href="#exp3"><h4> Growth of bacteria </h4></a></br>  
+
        <a href="#exp6"><h4> 125. PCR of A1, A2, B1, B2, D1, D2, E1 and C2 </h4></a><br/>
−
          <a href="#exp4"><h4> Extraction of plasmid DNA </h4></a></br>
+
        <a href="#exp7"><h4> 126. Analysis of PCR products from August 1 </h4></a><br/>  
 +
        <a href="#exp8"><h4> 127. PCR clean up </h4></a><br/>
 +
        <a href="#exp9"><h4> 128. Ligation of PCR products with TOPO cloning </h4></a><br/>
 +
<a href="#exp10"><h4> 129. Transformation in TOP10 competent cells </h4></a><br/>
 +
<a href="#exp11"><h4> 130. PCR of A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2  </h4></a><br/>
 +
</p>
 +
    <p><h3><B> August 3, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp12"><h4> 131. Analysis of PCR products from August 2, 2016  </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp13"><h4> 132. Miniprep of cultures C1 v2 and C2 v2 from August 2 </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp14"><h4> 133. Digestion of C1 v2 and C2 v2 </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp15"><h4> 134. Electrophoresis of C1 v2 and C2 v2 </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp16"><h4> 135. DNA extraction from the gel </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp17"><h4> 136. Ligation of C1.2&#8260;C1.5 and C2.1&#8260;C2.2 with pET43.1 (a+) and transformation with TOP10 competent cells </h4></a><br/>
 +
</p>
 +
    <p><h3><B>August 4, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp18"><h4> 137. Miniprep of B1&#8260;B2 and E1&#8260;E2 </h4></a><br/>
 +
        <a href="#exp19"><h4> 138. Digestion of B1&#8260;B2, E1&#8260;E2 and pET43.1 (a+) with Hind III and Xba I </h4></a><br/>
 +
        <a href="#exp20"><h4> 139. Dephosphorylation of digested pET43.1 (a+) </h4></a><br/>
 +
        <a href="#exp21"><h4> 140. PCR of A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2 without MgCl<sub>2<sub> </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp22"><h4> 141. Preculture of TOPO – C1 v2 (2) and (5) and TOPO – C2 v2 (1) and (2) </h4></a><br/>
 +
<a href="#exp23"><h4> 142. Electrophoresis of PCR products A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2 </h4></a><br/>
 +
<a href="#exp24"><h4> 143. Next PCR of A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2 </h4></a><br/>
 +
<a href="#exp25"><h4> 144. Pool of inserts C1 v2 and C2 v2 </h4></a><br/>
 +
</p>
 +
    <p><B><h3> August 5, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
            <a href="#exp26"><h4> 145. Digestion of B1&#8260;B2 and C1&#8260;C2  </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp27"><h4> 146. Ligation of C1 and C2 with pET43.1 (a+) digested and dephosphorylated </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp28"><h4> 147. Transformation of TOP10 competent cells </h4></a><br/>
 +
            <a href="#exp29"><h4> 148. Ligation of B1&#8260;B2&#8260;C1&#8260;C2 in pET43.1 (a+) </h4></a><br/>
 +
<a href="#exp30"><h4> 149. Transformation of B1&#8260;B2&#8260;C1&#8260;C2 in TOP10 </h4></a><br/>
 +
</p>
 +
 
 +
 
 +
   
  
−
    </p>
 
  
 
     <div class="lightbox" id="exp1">
 
     <div class="lightbox" id="exp1">
 
       <figure>
 
       <figure>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
−
             <figcaption>
+
             <figcaption>
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) before sending for sequencing (inserts B1 and C2)</br></br>
+
               <U> Aim:</U> Check if the sillification is working with different volume of HCl and TEOS. <br/> <br/>
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
                <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/2/2a/Protocol-silification-assay_Pasteur_Paris2016.pdf">link</a><br/><br/>
−
               <U>What we did in the lab:</U></br>
+
               <U>What we did in the lab:</U><br/>
−
               <U>Materials:</U></br>
+
               <U>Materials:</U><br/>
−
                   &bull; Nanodrop (Thermofisher)</br>
+
                   &bull; 1.5 ml Eppendorfs <br/>
−
                  &bull; Elution buffer from QIAGEN kit</br>
+
&bull; Silification protein <br/>
−
                  &bull; Microbiology equipment (Follow this link)</br></br>
+
&bull; HCl 1 M <br/>
 +
&bull; TEOS (Tetraethyl ortho silicate, Sigma) <br/>
 +
&bull; Shaking incubator <br/>
 +
&bull; 15 ml Falcon <br/>
 +
&bull; Buffer A (See protein purification protocol)<br/>
 +
&bull; 10 &#956;l and 200 &#956;l pipettes <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      <li>1. In a 1.5 ml Eppendorf prepare a sample with the fraction that contains protein c2, add 1 ml of HCl 1mM, 65.8 &#956;l of TEOS and let it incubate for 4 minutes in the rotating incubator</li>
 +
<li>2. In a 15 ml Falcon, put 9 ml of buffer A and add the previous sample</li>
 +
<li>3. Follow if silification initiates and progresses at various times :</li> <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 84</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Times</th>
 +
                            <th> Comments </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 10 minutes </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 15 minutes </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> Microscopic crystalline specs appear </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 30 minutes </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> Microscopic crystalline specs continue to appear </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 50 minutes </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> Microscopic crystalline specs continue to appears + crystalline specs grow and form a precipitate </td>
 +
                          </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
4. Redo this experiment with 1 ml of TEOS, 50 &#956;l of protein and vortex: <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 85</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Times</th>
 +
                            <th> Comments </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 15 minutes </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> Crystalline specs appear </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 2 hours </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> Crystalline specs continue to appear </td>
 +
                          </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
5. Redo the experiment with 1 ml of TEOS to see the catalytic activity of the protein : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 86</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Times</th>
 +
                            <th> Comments </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 1h45 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                          </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
6. Redo the experiment with 50 &#956;l of HCl 1 mM and 50 &#956;l of protein<br/>
 +
7.Redo the experiment with 50 &#956;l of HCl 1 mM but without our protein<br/><br/>
  
−
                    <U>Method:</U></br>
+
<U>Results: </U><br/>
−
                    Analyze absorbance at 260nm</br>
+
When glycerol is added to the sample, as an amphiphilic modifier, an emulsion takes place which mean that glycerol act as a surfactant. <br/>
−
                    Clean the Nanodrop with water</br>
+
Our protein is a catalyst
−
                    Make the blank with 1ul of elution buffer</br>
+
<br/><br/><br/>
−
                    Put 1ul of your sample on the Nanodrop</br>
+
              </p>
−
                    Make the measure and clean the Nanodrop between each measure</br></br>
+
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
−
                    <U>Results:</U></br>
+
 
−
                    <table>
+
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp2">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Test the specificity of primers For and Rev to obtain more insert.
 +
We also switched to the Takara EX DNA polymerase for its terminal deoxynucleotide transferase activity, which adds an deoxy-A residue at the 3' end of the PCR product<br/> <br/>
 +
            <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/b/be/T--Pasteur_Paris--PCR_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; dNTP mix <br/>
 +
&bull; MgCl<sub>2</sub> 25 mM <br/>
 +
&bull; EX polymerase buffer 10X <br/>
 +
&bull; RNAse free water <br/>
 +
&bull; C1&#8260;C2 insert DNA <br/>
 +
&bull; primers For and Rev <br/>
 +
&bull; Takara EX DNA polymerase <br/>
 +
&bull; PCR machine <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l and 200 &#956;l pipettes <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1. Use a Globalmix with : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 87</U></p></i></caption>
 
                     <thead>
 
                     <thead>
 
                         <tr>
 
                         <tr>
−
                             <th>Absorbance at 260nm</th>
+
                             <th> </th>
−
                             <th>A260</th>
+
                             <th> Volumes (&#956;l) </th>
−
                            <th>A280</th>
+
−
                            <th>A260/280</th>
+
−
                            <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>
+
 
                         </tr>
 
                         </tr>
 
                   </thead>
 
                   </thead>
 
                     <tbody>
 
                     <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A1(1)</p></strong></td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> dNTP </p></strong></td>
−
                             <td>0.202 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 25 </td>
−
                            <td>0.124</td>
+
−
                            <td>1.62 </td>
+
−
                            <td>10.1</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A1(2)</p></strong></td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Mgcl<sub>2</sub> </p></strong></td>
−
                            <td>0.259 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 25 </td>
−
                            <td>0.169</td>
+
−
                            <td>1.53 </td>
+
−
                             <td>13.0 </td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2(1)</p></strong></td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer 10X </p></strong></td>
−
                             <td>0.179</td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 50 </td>
−
                            <td>0.105</td>
+
−
                            <td>1.70 </td>
+
−
                            <td>8.9 </td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2(2)</p></strong></td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> RNAse free water </p></strong></td>
−
                             <td>0.179 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 36.5 </td>
−
                            <td>0.103</td>
+
−
                            <td>1.73</td>
+
−
                            <td>8.9 </td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 +
<tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Final </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 50 </td>
 +
                          </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
2. For the next step use : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 88</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Tube </th>
 +
                            <th> Name </th>
 +
                            <th> Premix (&#956;l) </th>
 +
                            <th> C1 (&#956;l) </th>
 +
                            <th> C2 (&#956;l) </th>
 +
                            <th> Primer For (&#956;l) </th>
 +
                            <th> Primer Rev (&#956;l) </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2(3)</p></strong></td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 1 </p></strong></td>
−
                             <td>0.098 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> C1 insert (For +Rev) </td>
−
                             <td>0.052</td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
−
                             <td>1.86 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
−
                             <td>4.9 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2(4)</p></strong></td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 2 </p></strong></td>
−
                             <td>0.152 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> C1 For </td>
−
                             <td>0.099</td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
−
                             <td>1.53</td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
−
                             <td>7.6 </td>
+
                             <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
−
                                              </tbody>
+
                          <tr>
−
                  </table>
+
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 3 </p></strong></td>
−
                  <center>Absorbance</center></br></br></br>
+
                            <td align="center" ; valign = “center”> C1 Rev </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 4 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> C2 insert (For + Rev) </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 5 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> C2 For </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 6 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> C2 Rev </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 7 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> Without DNA </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 8 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> C1 without primer </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 9 </p></strong></td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> C2 without primer </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 46.5 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                            <td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                          </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
3. For the PCR program, start at 24&#176;C, add 0.5 &#956;l of Takara enzyme and proceed to 94&#176;C. Annealing is set at 55&#176;C.
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
−
             </p>
+
 
−
          </figcaption>
+
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp3">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
             <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Verification of the content of the fractions obtained from the Ni-NTA column chromatography. <br/> <br/>
 +
 
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
−
      </p>
 
  
  
  
  
−
     <div class="lightbox" id="exp2">
+
     <div class="lightbox" id="exp4">
 
       <figure>
 
       <figure>
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
+
          <a href="#" class="closemsg"></a>
−
              <figcaption>  
+
            <figcaption>
−
                  <p><U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert C2 in pET43.1a in BL21(DE3) from 22/08 and A1/C2 in pET43.1a in TOP1O. </br>
+
              <p>
−
                  In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.</br></br>
+
              <U> Aim:</U> Test the specificity of primers For and Rev to obtain more insert. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/60/T--Pasteur_Paris--Gel_electrophoresis_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; Loading buffer 6X <br/>
 +
&bull; PCR products  <br/>
 +
&bull; Inserts C1 v2, C2 v2  <br/>
 +
&bull; Primer S (For) <br/>
 +
&bull; Primer AS (Rev) <br/>
 +
&bull; Electrophoresis chamber, and power supply  <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l pipette <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1. Add 5 &#956;l of DNA and 1 &#956;l of buffer 6X to each sample
 +
2. Use 6 &#956;l of molecular weight marker and deposit each sample in the wells :<br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 89</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> L1 </th>
 +
                            <th> L2 </th>
 +
                            <th> L3 </th>
 +
                            <th> L4 </th>
 +
                            <th> L5 </th>
 +
                            <th> L6 </th>
 +
                            <th> L7 </th>
 +
                            <th> L8 </th>
 +
                            <th> L10 </th>
 +
                            <th> L11 </th>
 +
                            <th> L12 </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> M. weight Marker </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C1 + insert </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C1 + primer S </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C1 + primer AS </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C2 + insert </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C2 + primer S </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C2 + primer AS </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> Without DNA </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C1 without primer </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> C2 without primer </td>
 +
                          </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
2. Start the electrophoresis at 50 V and 0.01 A for 10 minutes, then put it at 90 V and 0.03 A <br/><br/>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
−
                  <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 
−
                  <U>What we did in the lab:</U></br>
 
−
                  <U>Materials:</U></br>
 
−
                    &bull; Microbiology equipement </br>
 
−
                    &bull; 50mL erlenmeyers</br>
 
−
                    &bull; Carbenicillin 50 mg/ml</br>
 
−
                    &bull; LB medium</br></br>
 
  
−
                  <U>Method:</U></br>
 
−
                  One colony is picked from the plates and shaken in 25.0 mL of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml.</br>
 
−
                  The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight.</br></br>
 
  
 +
    <div class="lightbox" id="exp5">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Get back the DNA amplified by PCR. <br/> <br/>
 +
<br/><br/><br/>
 
               </p>
 
               </p>
 
             </figcaption>
 
             </figcaption>
Line 354: Line 633:
 
     </div>
 
     </div>
  
−
     <div class="lightbox" id="exp3">
+
 
 +
 
 +
     <div class="lightbox" id="exp6">
 
       <figure>
 
       <figure>
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
+
          <a href="#" class="closemsg"></a>
−
              <figcaption>  
+
            <figcaption>
−
                  <p><U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.</br></br>
+
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Increase the quantity of DNA for cloning. <br/> <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/b/be/T--Pasteur_Paris--PCR_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
<U> Results :</U><br/>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/9/9b/Week_9_Figure_2_Gel_de_la_PCR_du_01-08-16_A1_A2_B1_B2_D1_D2_E1_E2.jpg"; alt = "PCR gel of A1_A2_B1_B2_D1_D2_E1_E2"/>
 +
<i><p><U>Figure 11 :</U> PCR gel of A1/A2/B1/B2/D1/D2/E1/E2 </p></i></center>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
−
                  <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 
−
                  <U>What we did in the lab:</U></br>
 
−
                  <U>Materials:</U></br>
 
−
&bull; 2 2L erlenmeyers</br>
 
−
&bull; LB (lysogeny Luria broth)</br>
 
−
&bull; IPTG (0.1M)</br>
 
−
&bull; Precultures in 25ml erlenmeyers</br>
 
−
&bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)</br>
 
−
&bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
 
−
&bull; Centrifuge</br>
 
−
&bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)</br></br>
 
  
−
                  <U>Method:</U></br>
 
−
Put 1L of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150RPM</br>
 
−
Once warmed, add 12.5ml of preculture in each erlenmeyer</br>
 
−
Let grow in the shaking incubator.</br>
 
−
Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min</br></br>
 
  
−
  <table>
+
    <div class="lightbox" id="exp7">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Test the specificity of primers For and Rev to obtain more insert. <br/> <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/60/T--Pasteur_Paris--Gel_electrophoresis_protocol.pdf">link</a><br/><br/> <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; Agarose  <br/>
 +
&bull; Ethidium bromide drops (EB)  <br/>
 +
&bull; Molecular weight ladder (Gene ruler 1 Kb, Thermofisher) <br/>
 +
&bull; Loading buffer 6X  <br/>
 +
&bull; PCR products  <br/>
 +
&bull; Electrophoresis chamber, power supply  <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l pipette <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1. Make an agarose gel at 0.7&#37;
 +
2. Prepare the samples with 5 &#956;l of PCR products and 1 &#956;l of loading buffer 6X
 +
3. Depose each samples in the wells : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 90</U></p></i></caption>
 
                     <thead>
 
                     <thead>
 
                         <tr>
 
                         <tr>
−
                             <th>Time</th>
+
                             <th> L1 </th>
−
                             <th>C2(1)</th>
+
                             <th> L2 </th>
−
                             <th>C2(2)</th>
+
                             <th> L3 </th>
 +
                            <th> L4 </th>
 +
                            <th> L5 </th>
 +
                            <th> L6 </th>
 +
                            <th> L7 </th>
 +
                            <th> L8 </th>
 +
                            <th> L9 </th>
 +
                            <th> L10 </th>
 +
                            <th> L11 </th>
 +
                            <th> L12 </th>
 +
                            <th> L13 </th>
 +
                            <th> L14 </th>
 +
                            <th> L15 </th>
 
                         </tr>
 
                         </tr>
 
                   </thead>
 
                   </thead>
 
                     <tbody>
 
                     <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>9:36AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> Ladder </td>
−
                            <td>0.024 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
−
                            <td>0.023 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> A1 </td>
−
                           </tr>
+
<td align="center" ; valign = “center”> A2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> B1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> B2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> D1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> D2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> E1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> E2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
                           </tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
4. Begin the electrophoresis at 50 V for 15 minutes, then at 90 V for 1h30 <br/><br/>
 +
<U>Result</U><br/>
 +
There are streaks in lanes 3, 4, 9 and 11 which mean that the PCR did not work. But it seems to work for lanes 6, 7, 13 and 14. <br/>
 +
The PCR must be done another time for A1&#8260;A2 and D11&#8260;D2 with a lower temperature (1&#176;C).
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp8">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Test the specificity of primers For and Rev to obtain more insert. <br/> <br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; Qiagen PCR clean up kit
 +
&bull; PCR products
 +
&bull; 200 &#956;l pipette <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1. Prepare the 8 samples: <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 91</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> Samples </th>
 +
                            <th> A1 </th>
 +
                            <th> A2 </th>
 +
                            <th> B1 </th>
 +
                            <th> B2 </th>
 +
                            <th> D1 </th>
 +
                            <th> D2 </th>
 +
                            <th> E1 </th>
 +
                            <th> E2 </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>10:06AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer A (&#956;l) </p></strong><</td>
−
                            <td>0.049</td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
−
                            <td>0.046 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
−
                          </tr>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 90 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
2. Follow the protocol of the Qiagen PCR clean up kit <br/><br/>
 +
<U>Result</U><br/>
 +
We obtained 25 &#956;l of each insert purified by PCR.
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp9">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Test the specificity of primers For and Rev to obtain more insert. <br/> <br/>
 +
                <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/6f/T--Pasteur_Paris--Ligation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; PCR products <br/>
 +
&bull; Salt solution <br/>
 +
&bull; pET43.1 vector DNA <br/>
 +
&bull; Incubator 37&#176;C <br/>
 +
&bull; 10 µl pipettes <br/>
 +
&bull; 1 ml Eppendorfs <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1 For each inserts, prepare the following mix : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 92</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> </th>
 +
                            <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>11:02AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> PCR products </p></strong></td>
−
                            <td>0.175</td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 4 </td>
−
                            <td>0.165</td>
+
</tr>
−
                          </tr>
+
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Salt solution </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  pET 43.1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 6 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
2. Let ligate for 5 minutes at room temperature
 +
3. Incubate for 10 minutes at 65&#176;C.
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp10">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Check if our plasmid was inserted in the bacteria, and to recover larger amounts of it. <br/> <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/c/ca/T--Pasteur_Paris--Transformation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
 
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp11">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Increase the quality of DNA. <br/> <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/b/be/T--Pasteur_Paris--PCR_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; dNTPs <br/>
 +
&bull; MgCl<sub>2</sub> <br/>
 +
&bull; Buffer 20X <br/>
 +
&bull; RNAse free <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l , 20 µl and 200 &#956;l pipettes <br/>
 +
&bull; 1.5 ml Eppendorfs <br/>
 +
&bull; A1&#8260;A2 and B1&#8260;B2 inserts <br/>
 +
&bull; PCR machine <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l 20 µl and 200 &#956;l pipettes <br/>
 +
&bull; 1.5 ml Eppendorfs <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1. Prepare a Globalmix with : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 93</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> </th>
 +
                            <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>11:36AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> dNTPs </p></strong></td>
−
                            <td>0.395 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 12.5</td>
−
                            <td>0.402 </td>
+
</tr>
−
                          </tr>
+
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  MgCl<sub>2</sub> </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 12.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Buffer 20X </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 25 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  RNAse free </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 182.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Primer S (For) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Primer AS (Rev) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 242.5 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
2. Prepare the following samples :
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 94</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> </th>
 +
                            <th> A1 </th>
 +
                            <th> A2 </th>
 +
                            <th> B1 </th>
 +
                            <th> B2 </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>12:05AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> V<sub>inserts</sub> (&#956;l) </p></strong></td>
−
                            <td>0.568</td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
−
                            <td>0.540 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
−
                          </tr>        
+
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> V<sub>globalmix</sub> </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
3. Launch the PCR
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp12">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Check the efficiency of the PCR. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/60/T--Pasteur_Paris--Gel_electrophoresis_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; Agarose <br/>
 +
&bull; Ethidium bromide drops <br/>
 +
&bull; Molecular weight ladder (Gene ruler 1 Kb, Thermofisher) <br/>
 +
&bull; Loading buffer 6X <br/>
 +
&bull; PCR products <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l pipette <br/>
 +
&bull; Electrophoresis machine <br/>
 +
&bull; 1.5 ml Eppendorfs <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
      1. Make an agarose gel at 0.7&#37;
 +
2. Prepare the samples with 5 &#956;l of PCR products and 1 &#956;l of loading buffer 6X <br/>
 +
3. Deposit each sample in the wells : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 95</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> L1 </th>
 +
                            <th> L2 </th>
 +
                            <th> L3 </th>
 +
                            <th> L4 </th>
 +
                            <th> L5 </th>
 +
                            <th> L6 </th>
 +
                            <th> L7 </th>
 +
                            <th> L8 </th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>12:27AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> Ladder (6 &#956;l) </td>
−
                            <td>0.658 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
−
                            <td>0.638</td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> A1 : 5 &#956;l of DNA + 1 &#956;l of buffer 6X </td>
−
       </tr>
+
<td align="center" ; valign = “center”> A2 : 5 &#956;l of DNA + 1 &#956;l of buffer 6X </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> D1 : 5 &#956;l of DNA + 1 &#956;l of buffer 6X </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> D2 : 5 &#956;l of DNA + 1 &#956;l of buffer 6X </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
4. Begin the electrophoresis at 50 V for 15 minutes, then at 90 V for 1h30.
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp13">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Get DNA back. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link <br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/0/04/Week_9_Figure_3_gel_miniprep_topoclonning_C1_de_1_à_8_digéré_XbaI-HindIII.jpg"; alt = "Digestion gel of C1 (1-8)"/>
 +
<i><p><U>Figure 12 :</U> Digestion gel of C1 (1-8)</p></i></center>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp14">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Recombine the inserts with the plasmid. <br/> <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/ab/T--Pasteur_Paris--Restriction_digestion_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
&bull; Hind III (NEB) <br/>
 +
&bull; Xba I 5NEB) <br/>
 +
&bull; Buffer CutSmart 10X (NEB) <br/>
 +
&bull; H<sub>2</sub>O <br/>
 +
&bull; 1.5 Eppendorfs <br/>
 +
&bull; C1 v2 and C2 v2 <br/>
 +
&bull; Incubator 37&#176;C <br/>
 +
&bull; 20 &#956;l and 200 &#956;l pipettes <br/><br/>
 +
              <U>Method:</U><br/>
 +
       1. Prepare a Globalmix : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 96</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> </th>
 +
                            <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
</tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>12:38AM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> HindIII </p></strong></td>
−
                            <td>0.694 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> 20 </td>
−
                            <td>0.680 </td>
+
</tr>
−
      </tr>
+
  <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  XbaI </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 20 </td>
 +
</tr>
 +
  <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  Buffer CutSmart 10X </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 50 </td>
 +
</tr>
 +
  <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p>  H<sub>2</sub>O </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 10 </td>
 +
</tr>
 +
  <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 100 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
2. Put 5 &#956;l of the mix in each tube and add 20 &#956;l of DNA C1 v2 and C2 v2 <br/>
 +
3. Let digest for 2 hours at 37&#176;C and inactivate enzymes for 5 minutes at 65&#176;C
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
    <div class="lightbox" id="exp15">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Check if our inserts have been correctly digested by the enzyme. <br/> <br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/60/T--Pasteur_Paris--Gel_electrophoresis_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
Lane 1 : <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 97</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> 1 </th>
 +
                            <th> 2 </th>
 +
                            <th> 3 </th>
 +
                            <th> 4 </th>
 +
                            <th> 5 </th>
 +
                            <th> 6 </th>
 +
                            <th> 7 </th>
 +
                            <th> 8 </th>
 +
                            <th> 9 </th>
 +
                            <th> 10 </th>
 +
                            <th> 11 </th>
 +
                            <th> 12 </th>
 +
                            <th> 13 </th>
 +
</tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                            <td><strong><p>14:31PM</p></strong></td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> Ladder </td>
−
                             <td>0.872 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
−
                             <td>0.859 </td>
+
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.1 </td>
−
      </tr>
+
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
−
                      </tbody>
+
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.3 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.4 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th> 14 </th>
 +
                            <th> 15 </th>
 +
                            <th> 16 </th>
 +
                            <th> 17 </th>
 +
                            <th> 18 </th>
 +
                            <th> 19 </th>
 +
                            <th> 20 </th>
 +
                            <th> 21 </th>
 +
                            <th> 22 </th>
 +
                            <th> 23 </th>
 +
                            <th> 24 </th>
 +
                            <th> 25 </th>
 +
                            <th>  </th>
 +
</tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.6 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.7 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C1.8 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”>  </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
Lane 2: <br/>
 +
                  <table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 98</U></p></i></caption>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                             <th> 1 </th>
 +
                            <th> 2 </th>
 +
                            <th> 3 </th>
 +
                            <th> 4 </th>
 +
                            <th> 5 </th>
 +
                            <th> 6 </th>
 +
                            <th> 7 </th>
 +
                            <th> 8 </th>
 +
                            <th> 9 </th>
 +
                            <th> 10 </th>
 +
                            <th> 11 </th>
 +
                            <th> 12 </th>
 +
                            <th> 13 </th>
 +
</tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> Ladder </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.3 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.4 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.5 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                             <th> 14 </th>
 +
                            <th> 15 </th>
 +
                            <th> 16 </th>
 +
                            <th> 17 </th>
 +
                            <th> 18 </th>
 +
                            <th> 19 </th>
 +
                            <th> 20 </th>
 +
                            <th> 21 </th>
 +
                            <th> 22 </th>
 +
                            <th> 23 </th>
 +
                            <th> 24 </th>
 +
                            <th> 25 </th>
 +
                            <th>  </th>
 +
</tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.6 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.8 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”; colspan = 2> C2.9 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 
                   </table>
 
                   </table>
−
                  <center>Optical Density</center></br></br></br>
+
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
  
−
5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1mM. (12:57AM)</br>
+
 
−
6. The last measure before induction is pelleted 3min at 8000g and stored at -20°C.</br>
7. Let induce overnight in the shaking incubator</br>
+
    <div class="lightbox" id="exp16">
−
8. After 7 hours of induction, measure the OD and store the measure pelleted at -20°C.</br>
+
      <figure>
−
9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.
+
          <a href="#" class="closemsg"></a>
−
</br></br>
+
            <figcaption>
−
            </p>
+
              <p>
−
          </figcaption>
+
              <U> Aim:</U> Get back the DNA which was digested and purified. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/4/4e/T--Pasteur_Paris--Gel_extraction_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; Qiagen Gel Extraction Kit <br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
Use Qiagen extraction kit with a final volume of 50 &#956;l. <br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 99</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> Sample </th>
 +
        <th> Weight of gel (g) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.2 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3435 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.4 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3564 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.5 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3825 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.6 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.4318 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.7 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.4392 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.8 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3564 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1.10 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3800 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C2.1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3179 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C2.2 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.2500 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C2.3 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3910 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C2.9 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3668 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C2.10 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.3934 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
  
−
     <div class="lightbox" id="exp4">
+
 
 +
 
 +
     <div class="lightbox" id="exp17">
 
       <figure>
 
       <figure>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
 
           <a href="#" class="closemsg"></a>
−
             <figcaption>
+
             <figcaption>
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1a with the inserts A1/C2 from cultures made on the 1/09. </br>The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep.</br></br>
+
               <U> Aim:</U> Put the insert into the plasmid and transform the plasmid into bacteria. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/6f/T--Pasteur_Paris--Ligation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
<U>Results (on the August 4, 2016)</U><br/>
 +
Several colonies have grown but they are too small so we let them grow more. But C1.2 has much more colonies so we spread it into another Petri dish. <br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 
−
              <U>Materials:</U></br>
 
−
                  &bull; 50 ml Falcon tube</br>
 
−
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
 
−
                  &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41)</br>
 
−
                  &bull; QIAGEN Miniprep kit</br>
 
−
                  &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this link)</br></br>
 
  
−
<U>Method:</U></br>
 
−
  The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below.</br></br>
 
  
 +
    <div class="lightbox" id="exp18">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Get back the DNA from bacteria. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/d/d5/T--Pasteur_Paris--Miniprep_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
<U> Results </U><br/>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/2/2b/Week_9_Figure_4_gel_miniprep_topocloning_de_B1_et_B2_colonies_1_a_10_digéré_X%2BH_05-05-16.jpg"; alt = "Digestion gel of B1/B2 (1-10)"/>
 +
<i><p><U>Figure 13 :</U> Digestion gel of B1/B2 (1-10)</p></i></center>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/c/cf/Week_9_Figure_5_gel_miniprep_topocloning_de_E1_et_E2_colonies_1_a_10_digéré_X%2BH_05-05-16.jpg"; alt = "Digestion gel of E1/E2 (1-10)"/>
 +
<i><p><U>Figure 14 :</U> Digestion gel of E1/E2 (1-10)</p></i></center>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
  
−
Follow QIAGEN kit steps. Final volume: 100 &#181;L</br></br>
 
  
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp19">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Prepare the ligation. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/ab/T--Pasteur_Paris--Restriction_digestion_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; 1.5 ml Eppendorfs <br/>
 +
&bull; DNA <br/>
 +
&bull; Buffer CutSmart (NEB) <br/>
 +
&bull; HindIII (NEB) <br/>
 +
&bull; XbaI (NEB) <br/>
 +
&bull; H<sub>2</sub>O <br/>
 +
&bull; Samples B1&#8260;B2, E1&#8260;E2 <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l and 20 &#956;l pipettes <br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. Make a master mix with : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 100</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
        <th> pET 43.1 </th>
 +
        <th> B1&#8260;B2&#8260;E1&#8260;E2 </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> DNA </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 7.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 7.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer CutSmart </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 7.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> HindIII </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> XbaI </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> H<sub>2</sub>O </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 0.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 25 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 25 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
2. Distribute the volumes in each tube
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp20">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Avoid the religation of the plasmid with itself. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/c/c0/T--Pasteur_Paris--dephosphorylation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; 1.5 ml Eppendorfs <br/>
 +
&bull; Digested DNA <br/>
 +
&bull; Dephosphorylase rSAP (recombinant Shrimp alkaline phosphatase) (NEB) <br/>
 +
&bull; Buffer CutSmart <br/>
 +
&bull; H<sub>2</sub>O <br/>
 +
&bull; Incubator 37&#176;C <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l and 20 &#956;l pipettes
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. In a 1.5 ml Eppendorf, put : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 101</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Digested DNA </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 9 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Dephosphorylase</p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 0.2 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer CutSmart </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> H<sub>2</sub>O </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 8.8 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 20 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
2. Incubate one hour at 37&#176;C<br/>
 +
3. Incubate 5 minutes at 65&#176;C
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp21">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Increase the quantity of DNA. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/b/be/T--Pasteur_Paris--PCR_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; dNTP mix <br/>
 +
&bull; MgCl<sub>2</sub> 25 mM <br/>
 +
&bull; Buffer 10X <br/>
 +
&bull; RNAse free water <br/>
 +
&bull; Primer S <br/>
 +
&bull; Primer AS <br/>
 +
&bull; Samples A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2 <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l , 20 &#956;l and 200 &#956;l pipettes <br/>
 +
&bull; PCR machine <br/>
 +
&bull; Takara DNA polymerase enzyme <br/>
 +
&bull; 1.5 ml Eppendorfs
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. Prepare the mix : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 102</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> dNTPs </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 12.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> MgCl<sub>2</sub> </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer 10X </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 25 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> RNAse free </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 195 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Primer S (For) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Primer AS(Rev) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 242.5 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
2. To put the sample into the PCR machine, use the table : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 103</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> Tube </th>
 +
        <th> Names </th>
 +
        <th> Mix (&#956;l) </th>
 +
        <th> A1 (&#956;l)  </th>
 +
        <th> A2 (&#956;l)  </th>
 +
        <th> D1 (&#956;l)  </th>
 +
        <th> D2 (&#956;l)  </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> A1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 2 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> A2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216;</td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 3 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> D1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> 4 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> A1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
3. For hot start PCR, launch the PCR machine and once it is at 95°C, add 0.5 &#956;l of Takara enzyme in each tube<br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/c/ca/Week_9_Figure_6_PCR_A1_A2_D1_D2_sans_MgCl2_04-08-16.jpg"; alt = "PCR gel of A1/A2/D1/D2 without MGCl<sub>2</sub>"/>
 +
<i><p><U>Figure 15 :</U> PCR gel of A1/A2/D1/D2 without MGCl<sub>2</sub> </p></i></center>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp22">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Have more bacteria with the insert A. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/4/4b/T--Pasteur_Paris--Bacterial_culture_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; 50 ml Falcon <br/>
 +
&bull; LB medium <br/>
 +
&bull; 20 ml and 20 &#956;l pipettes <br/>
 +
&bull; TOPO <br/>
 +
&bull; C1 v2 and C2 v2 <br/>
 +
&bull; Carbenicillin 50 mg&#8260;ml <br/>
 +
&bull; Incubator <br/>
 +
&bull; LB medium
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. In a 50 ml Falcon, put 15 ml of LB medium <br/>
 +
2. Add 15 &#956;l of carbenicillin <br/>
 +
3. Add a colony in the Falcon. But for C1 v2 (2) we had to wait one more night because bacteria had not grown enough <br/>
 +
4. Let it incubate at 37&#176;C
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp23">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Check if the PCR is efficient. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/60/T--Pasteur_Paris--Gel_electrophoresis_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; Agarose <br/>
 +
&bull; A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2 <br/>
 +
&bull; Molecular weight marker ladder (Gene ruler 1 Kb, Thermofisher) <br/>
 +
&bull; Loading buffer 6X <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l pipette
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. Make a 0.7&#37; agarose gel <br/>
 +
2. Add 5 &#956;l of DNA and 1 &#956;l of loading buffer. But we used 10 &#956;l of DNA for the sample 4 <br/>
 +
3. Deposit the sample for the electrophoresis according to this: <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 104</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> L1 </th>
 +
        <th> L2 </th> 
 +
        <th> L3 </th>
 +
        <th> L4 </th>
 +
        <th> L5 </th>
 +
        <th> L6 </th>
 +
        <th> L7 </th>
 +
        <th> L8 </th>
 +
        <th> L19</th> 
 +
</tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> Ladder 6 &#956;l </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (1) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (2) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (3) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (4) </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
A lot of streaks appeared so it did not work as expected. We have to redo this experiment with the gradient mode
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp24">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Increase the quantity of DNA. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/b/be/T--Pasteur_Paris--PCR_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; dNTP mix <br/>
 +
&bull; MgCl<sub>2</sub> 25 mM <br/>
 +
&bull; Buffer 10X <br/>
 +
&bull; RNAse free <br/>
 +
&bull; Primer S <br/>
 +
&bull; Primer AS <br/>
 +
&bull; A1&#8260;A2 and D1&#8260;D2 <br/>
 +
&bull; 200 &#956;l pipette
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. Make a Globalmix with : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 105</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> dNTPs </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 72.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> MgCl<sub>2</sub> </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer 10X </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 145 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> RNAse free </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1131 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Primer S </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 29 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Primer AS </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 29 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1206.5 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
2. Prepare the samples : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 106</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> Name </th>
 +
        <th> Samples </th>
 +
        <th> Globalmix (&#956;l)  </th>
 +
        <th> DNA (&#956;l)  </th>
 +
</tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> A1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> to (7) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 of A1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> A2 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (8) to (14) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 of A2 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> D1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (15) to (21) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 of D1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> D2 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (22) to (28) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 48.5 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 of D2 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
3. Deposit the samples on the gel: <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 107</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> A1 </th>
 +
        <th> A2  </th>
 +
        <th> D1</th>
 +
<th> D2</th>
 +
</tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> A </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (1) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (8) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (15) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (22) </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> B </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (2) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (9) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (16) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (23) </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (3) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (10) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (17) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (24) </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> D </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (4) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (11) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (18) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (25) </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> E </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (5) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (12) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (19) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (26) </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> F </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (6) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (13) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (20) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (27) </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> G </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (7) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (14) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (21) </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> (28) </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
4. Make a 0.7% agarose gel and perform an electrophoresis with 5 &#181;l of DNA and 1 &#181;l of loading 6X buffer for each sample <br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/5/51/Week_9_Figure_7_Gel_de_la_PCR_A1_A2_B1_B2_D1_D2_E1_E2.jpg"; alt = "PCR gel of A1/A2/B1/B2/D1/D2/E1/E2"/>
 +
<i><p><U>Figure 16 :</U> PCR gel of A1/A2/B1/B2/D1/D2/E1/E2 </p></i></center>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp25">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Increase the DNA. <br/> <br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; C1&#8260;C2 <br/>
 +
&bull; Na Acetate (NaOAc) <br/>
 +
&bull; Ethanol (70&#37;) <br/>
 +
&bull; Incubator <br/>
 +
&bull; Buffer E <br/>
 +
&bull; 200 &#956;l and 1000 &#956;l pipette <br/>
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. Calculate the final volume for each insert : <br/>
 +
&emsp;For C1 : 50&#215;7 = 350 &#956;l<br/>
 +
&emsp;For C2 : 50&#215;5 = 250 &#956;l<br/>
 +
2. Add 1&#8260;10 of the volume of NaOAc and 2.5x volume of ethanol : <br/>
 +
&emsp;For C1 : 35 &#956;l of NaOAc and 875 &#956;l of ethanol <br/>
 +
&emsp;For C2 : 25 &#956;l of NaOAc and 625 &#956;l of ethanol <br/>
 +
3. Mix the samples and incubate 8 minutes at -80&#176;C <br/>
 +
4. Centrifuge 5 minutes at 4&#176;C and 15000 RPM. Then, throw out the supernatant <br/>
 +
5. Add 1 ml of ethanol ice cold (70&#37;) <br/>
 +
6. Centrifuge 15 minutes at 4&#176;C and 15000 RPM <br/>
 +
7. Throw out the supernatant and let dry at room temperature <br/>
 +
8. Resuspend the pellet in 50 &#956;l of buffer E.<br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
<center><img scr = "https://static.igem.org/mediawiki/2016/f/ff/Week_9_Figure_8_PCR_C1_v2_C2_v2_TakaraEx_01-08-2016.jpg"; alt = "PCR gel of C1 v2 / C2 v2 with Takara enzyme"/>
 +
<i><p><U>Figure 17 :</U> PCR gel of C1 v2 / C2 v2 with Takara enzyme </p></i></center>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp26">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Make the inserts ligate with the plasmid. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/ab/T--Pasteur_Paris--Restriction_digestion_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; 10 &#956;l, 20 &#956;l and 200 &#956;l pipette <br/>
 +
&bull; Hind III (NEB) <br/>
 +
&bull; Xba I (NEB) <br/>
 +
&bull; Buffer CutSmart <br/>
 +
&bull; H<sub>2</sub>O <br/>
 +
&bull; B1&#8260;B2 and C1&#8260;C2
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. Make a Globalmix with : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 108</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Hind III </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 45 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Xba I </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 45 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer CutSmart </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 112.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> H<sub>2</sub>O </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 67.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 270 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
2. Distribute this global mix in each of our 4 tubes so they will contain : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 109</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> </th>
 +
        <th> Volumes (&#956;l)  </th>
 +
</tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> DNA </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 20 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Hind III </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Xb aI </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer CutSmart </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> H<sub>2</sub>O </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1.5 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 26 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
3. Follow the protocol for digestion.
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp27">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Prepare the plasmid for the transformation. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/6f/T--Pasteur_Paris--Ligation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; C1&#8260;C2 <br/>
 +
&bull; pET43.1 <br/>
 +
&bull; T4 ligase <br/>
 +
&bull; Buffer 10X <br/>
 +
&bull; H<sub>2</sub>O <br/>
 +
&bull; Incubator <br/>
 +
&bull; 10 &#956;l and 20 &#956;l pipettes
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
1. In a 1.5 ml eppendorf, put : <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 110</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> C1 </th>
 +
        <th> C2 </th>
 +
        <th> pET 43.1 (a+) alone </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C1 (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 15 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> C2 (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216;  </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 15 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
</tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> pET 43.1a(+) (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 4 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 4 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 4 </td>
 +
</tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> T4 ligase (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer 10X (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2.2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2.2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2.2 </td>
 +
</tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> H<sub>2</sub>O (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216;  </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> &#216; </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 15 </td>
 +
</tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total (&#956;l) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 22.2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 22.2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 22.2 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><br/>
 +
2. Incubate for 1 hour at room temperature
 +
3. Incubate for 10 minutes at 65&#176;C
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp28">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Express our plasmid in bacteria. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/c/ca/T--Pasteur_Paris--Transformation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Materials</U><br/>
 +
&bull; Qiagen Extraction Kit
 +
<br/><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
Use the Qiagen gel extraction kit for a final volume of 50 &#956;l. <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 111</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th> Colonies </th>
 +
        <th> &#916;m (mg) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> B1 colony 1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 136 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> B1 colony 2 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 170 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> B2 colony 4 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 166 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> B2 colony 7 </strong></p></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 175 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> E1 colony 1 </strong></p></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 110 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> E1 colony 2 </strong></p></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 143 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> E2 colony 1 </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 108 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> E2 colony 2 </td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 128 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table><
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp29">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Ligate our inserts with the plasmid. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/6/6f/T--Pasteur_Paris--Ligation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
<U>Method:</U><br/>
 +
We use the next volumes: <br/>
 +
<table>
 +
<caption align="bottom" align="center"><i><p> <U>Table 112</U></p></i></caption>
 +
  <thead>
 +
      <tr>
 +
        <th>  </th>
 +
        <th> Volumes (&#956;l) </th>
 +
      </tr>
 +
  </thead>
 +
  <tbody>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strng><p> Insert (B1 or B2 or C1 or C2) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 15 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> pET43.1 (100 ng) </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> T4 ligase </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 1 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Buffer 10X </strong></p></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 2 </td>
 +
</tr>
 +
<tr>
 +
<td align="center" ; valign = “center”><strong><p> Total </p></strong></td>
 +
<td align="center" ; valign = “center”> 20 </td>
 +
</tr>
 +
</tbody>
 +
</table>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp30">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption>
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Put our ligated plasmid into bacteria. <br/> <br/>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/c/ca/T--Pasteur_Paris--Transformation_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
<U>Results</U><br/>
 +
48 hours later, no colony had grown so the transformation did not work, it has to be redone.
 +
<br/><br/><br/>
 
               </p>
 
               </p>
 
             </figcaption>
 
             </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
 +
</body>
 +
</html>

Latest revision as of 02:15, 20 October 2016