Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week13"

 
(7 intermediate revisions by 3 users not shown)
Line 157: Line 157:
 
   position: relative;
 
   position: relative;
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 
   text-shadow: 0 1px 0 #000;   
 +
  text-align: center;
 
}
 
}
  
Line 169: Line 170:
 
   top: 25%;
 
   top: 25%;
 
   width: 100%;
 
   width: 100%;
 +
  text-align : center;
 
}
 
}
  
Line 226: Line 228:
  
  
−
  <div id="week14">
+
  <div id= "week13">
−
    <p><h5><B>September 6, 2016:</B></h5></p>
+
        <p><h5><B>Week 13</B></h5></p>
−
    <p>
+
        <p><h3><B>August 29, 2016:</B></h3></p>
−
        <a href="#exp1"> <h4>Growth of bacteria </h4></a></br>  
+
            <p>
−
  </p>
+
            <a href="#exp1"><h4> 232. Measure the amount of DNA extracted from the miniprep</h4></a><br/>  
−
    <p><h5><B>September 7, 2016:</B></h5></p>
+
            </p>
−
    <p>
+
            <p><h3><B>September 1, 2016:</B></h3></p>
−
         <a href="#exp2"><h4> Purification of the protein </h4></a></br>  
+
            <p>
 +
         <a href="#exp2"><h4> 233. Harvest the culture with Midiprep</h4></a><br/>  
 
     </p>
 
     </p>
−
     <p><h5><B>September 8, 2016:</B></h5></p>
+
     <p><h3><B>September 2, 2016:</B></h3></p>
 
     <p>
 
     <p>
−
           <a href="#exp3"><h4> Protein gel on SDS-Page </h4></a></br>  
+
           <a href="#exp3"><h4> 234. Growth of bacteria </h4></a><br/>  
−
           <a href="#exp4"><h4> Harvest the culture with Miniprep </h4></a></br>
+
           <a href="#exp4"><h4> 235. Extraction of plasmid DNA </h4></a><br/>
  
 
     </p>
 
     </p>
−
<p><h5><B>September 9, 2016:</B></h5></p>
 
−
    <p>
 
−
          <a href="#exp5"><h4> Extraction of plasmid DNA </h4></a></br>
 
−
          <a href="#exp6"><h4> Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>
 
−
 
−
    </p>
 
−
 
−
 
  
 
     <div class="lightbox" id="exp1">
 
     <div class="lightbox" id="exp1">
Line 255: Line 250:
 
             <figcaption>   
 
             <figcaption>   
 
               <p>
 
               <p>
−
               <U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.</br> </br>  
+
               <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) before sending for sequencing (inserts B1 and C2)<br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; Nanodrop (Thermofisher)<br/>
 +
                  &bull; Elution buffer from QIAGEN kit<br/>
 +
                  &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>)<br/><br/>
  
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
                  <U>Method:</U><br/>
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
                  1. Analyze absorbance at 260nm<br/>
−
              <U>Materials:</U></br>
+
                  2. Clean the Nanodrop with water<br/>
−
                  &bull; 2 2L erlenmeyers</br>  
+
                  3. Make the blank with 1&#181;l of elution buffer<br/>
−
                  &bull; LB (lysogeny Luria broth)</br>  
+
                  4. Put 1 &#181;l of your sample on the Nanodrop<br/>
−
                  &bull; IPTG (0.1M)</br>
+
                  5. Make the measure and clean the Nanodrop between each measure <br/><br/>
−
                  &bull; Precultures in 25ml erlenmeyers</br>
+
−
                  &bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)</br>  
+
−
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
+
−
                  &bull; Centrifuge</br>  
+
−
                  &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)</br> </br>  
+
  
−
                  <U>Method:</U></br>
+
                <U>Results:</U><br/>
−
                  Put 1L of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150RPM</br>  
+
                <table>
−
                   Once warmed, add 12.5ml of preculture in each erlenmeyer</br>  
+
                   <caption align="bottom" align="center"><i><p>Table 1 : Absorbance</p></i></caption>
−
                  Let grow in the shaking incubator.</br>  
+
−
                  Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min</br> </br>  
+
−
 
+
−
                <table>
+
 
                     <thead>
 
                     <thead>
 
                         <tr>
 
                         <tr>
−
                             <th>Time</th>
+
                             <th>Absorbance at 260nm</th>
−
                             <th>C2(1)</th>
+
                             <th>A<sub>260</sub></th>
−
                             <th>C2(2)</th>
+
                             <th>A<sub>280</sub></th>
 +
                            <th>A<sub>260/280</sub<</th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;l)</th>
 
                         </tr>
 
                         </tr>
 
                   </thead>
 
                   </thead>
 
                     <tbody>
 
                     <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>10:30AM</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1(1)</p></strong></td>
−
                             <td>0</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.202 </td>
−
                             <td>0 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.124</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.62 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">10.1</td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>01:55PM</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A1(2)</p></strong></td>
−
                             <td>0.438</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.259 </td>
−
                             <td>/</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.169</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.53 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">13.0 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>2:25PM</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(1)</p></strong></td>
−
                             <td>0.602</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.179</td>
−
                             <td>0.429 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.105</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.70 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">8.9 </td>
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>2:45PM</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(2)</p></strong></td>
−
                             <td>0.679</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.179 </td>
−
                             <td>0.600 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.103</td>
−
                           </tr>        
+
                            <td align="center"; valign="center">1.73</td>
−
                      </tbody>
+
                            <td align="center"; valign="center">8.9 </td>
−
                  </table>
+
                           </tr>
−
                  <center>Optical Density</center></br></br></br>
+
                          <tr>
−
 
+
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(3)</p></strong></td>
−
 
+
                            <td align="center"; valign="center">0.098 </td>
−
                5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1mM. (3:00PM)</br>  
+
                            <td align="center"; valign="center">0.052</td>
−
                6. The last measure before induction is pelleted 3min at 8000g and stored at -20°C.</br> 
7. Let induce overnight in the shaking incubator at 15°C at 150RPM</br>  
+
                            <td align="center"; valign="center">1.86 </td>
−
                8. The day after, measure the OD and store the measure pelleted at -20°C.</br>  
+
                            <td align="center"; valign="center">4.9 </td>
−
                9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.</br> </br>  
+
                          </tr>
−
 
+
                          <tr>
 +
                            <td align="center"; valign="center"><strong><p>A2(4)</p></strong></td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.152 </td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">0.099</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">1.53</td>
 +
                            <td align="center"; valign="center">7.6 </td>
 +
                          </tr>
 +
                                              </tbody>
 +
                  </table><br/>
 +
                  <br/><br/><br/>
  
 
             </p>
 
             </p>
Line 319: Line 327:
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
−
      </p>
 
  
  
−
    <div class="lightbox" id="exp2">
 
−
      <figure>
 
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 
−
            <figcaption> 
 
−
              <p>
 
−
              <U> Aim:</U> Purifying the protein C2 produced by BL21(DE3) using a Fast Purification Liquid Chromatography. We use the culture induced the previous day. </br> </br>
 
  
  
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
     <div class="lightbox" id="exp2">
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
−
              <U>Materials:</U></br>
+
−
                &bull; Fast Purification Liquid Chromatography </br>
+
−
                &bull; Chaotropic reagent (Guanidinium 6M) </br>
+
−
                &bull; EDTA 0,1M </br>
+
−
                &bull; PMSF (100mM) </br>
+
−
                &bull; Ni 2+ solution (100mM) </br>
+
−
                &bull; Centrifuge (labo deshmukh) </br>
+
−
                &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl) </br>
+
−
                &bull; Buffer B (50mM Tris, 150mM of NaCl, 250mM Imidazole, pH=7.4) </br> </br>
+
−
 
+
−
                <U>Method:</U></br>
+
−
                Melt the pellet of bacteria C2 (from 1L culture) and resuspend it with 10ml of buffer A. We had 25ml of pellet we complete until 40ml with buffer A. </br>
+
−
                Add 40 &#181;L of PMSF to avoid protein denaturation. </br>
+
−
                Put the column on the FPLC, clean the FPLC with water and then fill it with buffer A. </br>
+
−
                Sonicate the sample three times one minute at 60%, wait 90 seconds between each sonication. </br>
+
−
                Centrifuge 25 min at 16000g (rotor JA 25.50) </br>
+
−
                Inject your sample in the FPLC </br>
+
−
                Get back several samples: </br>
+
−
                  &bull; C: Crude extract : before centrigugation </br>
+
−
                  &bull; P: Pellet </br>
+
−
                  &bull; SN: Supernatant </br>
+
−
                  &bull; F: Flow through (unfixed proteins) </br>
+
−
                  &bull; W: Wash 5% of buffer B </br>
+
−
                  &bull; Fractions (depending on the gradient) </br> </br>
+
−
              </p>
+
−
          </figcaption>
+
−
      </figure>
+
−
    </div>
+
−
 
+
−
 
+
−
 
+
−
 
+
−
     <div class="lightbox" id="exp3">
+
 
       <figure>
 
       <figure>
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
+
          <a href="#" class="closemsg"></a>
−
            <figcaption>
+
              <figcaption>  
−
              <p>
+
                  <p><U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert C2 in pET43.1a in BL21(DE3) from 22/08 and A1/C2 in pET43.1a in TOP1O. <br/>
−
              <U> Aim:</U> Get the size of the protein purified thanks to FPLC in order to know if it is our protein </br> </br>
+
                  In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.
 +
                <br/><br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/4/4b/T--Pasteur_Paris--Bacterial_culture_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
                  <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
                  <U>Materials:</U><br/>
 +
                    &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>) <br/>
 +
                    &bull; 50 ml erlenmeyers<br/>
 +
                    &bull; Carbenicillin 50 mg/ml<br/>
 +
                    &bull; LB medium<br/><br/>
  
−
              <U>Material: </U>
+
                  <U>Method:</U><br/>
−
              &bull; SDS-Page cuve </br>
+
                  1. One colony is picked from the plates and shaken in 25.0 ml of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml.<br/>
−
              &bull; SDS-Page gel (BIORAD) </br>
+
                  2. The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight.<br/>
−
              &bull; Protein migration buffer </br>
+
                  <br/><br/><br/>
−
              &bull; Protein ladder </br>
+
−
              &bull; Laemmli 2X </br>
+
−
              &bull; Coomassie Blue </br>
+
−
              &bull; Microbiology equipment (Follow this link) </br> </br>
+
−
 
+
−
              <U>Method:</U>
+
−
              In 9 1.5ml eppendorf, put 20 &#181;L of a sample and 20 &#181;L of Laemmli 2X. </br>
+
−
              Let denaturate the proteins 5min at 95°C </br>
+
−
              Place the gel into the cuve and fill it with migration buffer </br>
+
−
              Follow the next deposit table: </br>
+
−
 
+
−
                &bull; Fraction 13 </br>
+
−
                &bull; Fraction 15 </br>
+
−
                &bull; Fraction 17 </br>
+
−
                &bull; Fraction 19 </br>
+
−
                &bull; Fraction 21 </br>
+
−
                &bull; Fraction 23 </br>
+
−
                &bull; Fraction 25 </br>
+
−
                &bull; Fraction 27 </br>
+
−
                &bull; Protein gene ruler (8 &#181;L) </br>
+
−
              4. Launch the migration at 130V. </br>
+
−
              5. Wash the gel three times with distilled water during 5min. </br>
+
−
              6. Color the gel with Coomassie Blue diluted 1/5 during 30min. </br>
+
−
              7. Wash with distilled water for 5min then let wash 15min.
+
−
              </br> </br>
+
−
              </p>
+
−
          </figcaption>
+
−
      </figure>
+
−
    </div>
+
−
 
+
−
 
+
−
 
+
−
 
+
−
    <div class="lightbox" id="exp4">
+
−
      <figure>
+
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
+
−
            <figcaption> 
+
−
              <p>
+
−
              <U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 </br>
+
−
                In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.</br> </br>
+
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
−
              <U>Materials:</U></br>
+
−
                &bull; Microbiology equipement </br>
+
−
                &bull; 15 mL Falcons </br>
+
−
                &bull; Carbenicillin 50 mg/ml </br>
+
−
                &bull; LB medium </br> </br>
+
  
−
                <U>Method:</U></br>
+
              </p>
−
                One colony is picked from the plates and shaken in 5.0 mL of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml. </br>
+
−
                The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight. </br> </br>
+
−
              </p>
+
 
             </figcaption>
 
             </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
Line 432: Line 357:
  
  
−
    <div class="lightbox" id="exp5">
 
−
      <figure>
 
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 
−
            <figcaption> 
 
−
              <p>
 
−
              <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1a with the inserts A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 from cultures made on the 8/09. </br> The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep. </br>
 
  
−
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
+
     <div class="lightbox" id="exp3">
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
−
              <U>Materials:</U></br>
+
−
              &bull; 50 ml Falcon tube </br>
+
−
              &bull; Shaking incubator (INFORS HT) </br>
+
−
              &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41) </br>
+
−
              &bull; QIAGEN Miniprep kit </br>
+
−
              &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this link) </br> </br>
+
−
 
+
−
            <U>Method:</U></br>
+
−
              The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below. </br> </br>
+
−
 
+
−
 
+
−
            Follow QIAGEN kit steps. Final volume: 100 &#181;L </br> </br>
+
−
 
+
−
            </p>
+
−
          </figcaption>
+
−
      </figure>
+
−
    </div>
+
−
 
+
−
 
+
−
     <div class="lightbox" id="exp6">
+
 
       <figure>
 
       <figure>
−
          <a href="#" class="closemsg"></a>
+
          <a href="#" class="closemsg"></a>
−
            <figcaption>
+
              <figcaption>  
−
              <p>
+
                  <p><U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.<br/><br/>
−
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) </br> </br>
+
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/a/a4/T--Pasteur_Paris--Protein_induction_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
                  <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
                  <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; Two 2 l erlenmeyers<br/>
 +
                  &bull; LB (Luria broth)<br/>
 +
                  &bull; IPTG (0.1 M)<br/>
 +
                  &bull; Precultures in 25 ml Erlenmeyers<br/>
 +
                  &bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)<br/>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)<br/>
 +
                  &bull; Centrifuge<br/>
 +
                  &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)<br/><br/>
  
−
              <U>What we did in the lab:</U></br>
+
                  <U>Method:</U><br/>
−
              <U>Materials:</U></br>
+
                  1. Put 1 l of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150 rpm.<br/>
−
                    &bull; Nanodrop (Thermofisher) </br>
+
                  2. Once warmed, add 12.5 ml of preculture in each erlenmeyer.<br/>
−
                    &bull; Elution buffer from QIAGEN kit </br>
+
                  3. Let grow in the shaking incubator.<br/>
−
                    &bull; Microbiology equipment (Follow this link) </br> </br>
+
                  4. Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min<br/>
  
−
                <U>Method:</U></br>
+
                  <table>
−
                Analyze absorbance at 260nm </br>
+
                  <caption align="bottom" align="center"><i><p><U>Table 140 :</U> Optical Density</p></i></caption>
−
                Clean the Nanodrop with water </br>  
+
−
                Make the blank with 1ul of elution buffer </br>
+
−
                Put 1ul of your sample on the Nanodrop </br>
+
−
                Make the measure and clean the Nanodrop between each measure </br> </br>
+
−
 
+
−
                <U>Results:</U></br>
+
−
                <table>
+
 
                     <thead>
 
                     <thead>
 
                         <tr>
 
                         <tr>
−
                             <th>Absorbance at 260nm</th>
+
                             <th>Time</th>
−
                             <th>A260</th>
+
                             <th>C2 (1)</th>
−
                             <th>A280</th>
+
                             <th>C2 (2)</th>
−
                            <th>A260/280</th>
+
−
                            <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>
+
 
                         </tr>
 
                         </tr>
 
                   </thead>
 
                   </thead>
 
                     <tbody>
 
                     <tbody>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A1</p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>9:36<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                            <td>0.645</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.024 </td>
−
                             <td>0.345</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.023 </td>
−
                             <td>1.87</td>
+
−
                            <td>32.3</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A1’ <sub>(diluted 1/2)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>10:06<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>1.314</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.049</td>
−
                             <td>0.704</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.046 </td>
−
                            <td>1.86 </td>
+
−
                            <td>65.7 </td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>11:02<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>1.404</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.175</td>
−
                             <td>0.752</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.165</td>
−
                            <td>1.87 </td>
+
−
                            <td>70.2</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>A2’<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>11:36<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>0.494</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.395 </td>
−
                             <td>0.269</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.402 </td>
−
                            <td>1.87</td>
+
−
                            <td>24.7</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>C1<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>12:05<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>0.305 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.568</td>
−
                             <td>0.165</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.540 </td>
−
                            <td>1.85 </td>
+
                           </tr>        
−
                            <td>15.2 </td>
+
−
                           </tr>
+
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>C1’<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>12:27<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>0.812 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.658 </td>
−
                             <td>0.445</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.638</td>
−
                            <td>1.83</td>
+
−
                            <td>40.6</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>C2<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>12:38<sub>AM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>0.499 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.694 </td>
−
                             <td>0.272</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.680 </td>
−
                            <td>1.83</td>
+
−
                            <td>24.9 </td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
 
                           <tr>
 
                           <tr>
−
                             <td><strong><p>C2’<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                             <td align="center"; valign="center"><strong><p>14:31<sub>PM</sub></p></strong></td>
−
                             <td>0.757 </td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.872 </td>
−
                             <td>0.402</td>
+
                             <td align="center"; valign="center">0.859 </td>
−
                            <td>1.88</td>
+
−
                            <td>37.8</td>
+
 
                           </tr>
 
                           </tr>
−
                          <tr>
+
                      </tbody>
−
                            <td><strong><p>D1<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
+
                   </table></br>
−
                            <td>0.441 </td>
+
−
                            <td>0.233</td>
+
−
                            <td>1.89</td>
+
−
                            <td>22.1 </td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>D1’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>0.725</td>
+
−
                            <td>0.396</td>
+
−
                            <td>1.83</td>
+
−
                            <td>36.3</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>D2<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>0.264 </td>
+
−
                            <td>0.141</td>
+
−
                            <td>1.87</td>
+
−
                            <td>13.2</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>D2’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>0.418 </td>
+
−
                            <td>0.216</td>
+
−
                            <td>1.94</td>
+
−
                            <td>20.9 </td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>E1<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>0.487 </td>
+
−
                            <td>0.266</td>
+
−
                            <td>1.83</td>
+
−
                            <td>24.3</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>E1’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>0.478 </td>
+
−
                            <td>0.247</td>
+
−
                            <td>1.94</td>
+
−
                            <td>24.0</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>E2<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.364</td>
+
−
                            <td>0.742</td>
+
−
                            <td>1.84</td>
+
−
                            <td>68.2</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                          <tr>
+
−
                            <td><strong><p>E2’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
+
−
                            <td>1.041 </td>
+
−
                            <td>0.562</td>
+
−
                            <td>1.85</td>
+
−
                            <td>52.1</td>
+
−
                          </tr>
+
−
                            </tbody>
+
−
                   </table>
+
−
                  <center>Absorbance</center></br></br></br>
+
  
 +
                    5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1mM. (12:57<sub>AM</sub>)<br/>
 +
                    6. The last measure before induction is pelleted 3min at 8000g and stored at -20°C.<br/>

 +
                    7. Let induce overnight in the shaking incubator<br/>
 +
                    8. After 7 hours of induction, measure the OD<sub>600 nm</sub> and store the measure pelleted at -20°C.<br/>
 +
                    9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.
 +
                    <br/><br/><br/>
 
             </p>
 
             </p>
 
           </figcaption>
 
           </figcaption>
 
       </figure>
 
       </figure>
 
     </div>
 
     </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp4">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1(a+) with the inserts A1/C2 from cultures made on the 1<sup>set</sup> of August. <br/>
 +
The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep.<br/><br/>
 +
<U> Protocol:</U> follow in this <a href="https://static.igem.org/mediawiki/2016/d/d5/T--Pasteur_Paris--Miniprep_protocol.pdf">link</a><br/><br/>
 +
              <U>What we did in the lab:</U><br/>
 +
              <U>Materials:</U><br/>
 +
                  &bull; 50 ml Falcon tube<br/>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)<br/>
 +
                  &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41)<br/>
 +
                  &bull; QIAGEN Miniprep kit</br>
 +
                  &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Science">link</a>)<br/><br/>
 +
 +
                <U>Method:</U><br/>
 +
                  The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below.<br/>
 +
                Follow QIAGEN kit steps with a final volume of 100 &#181;l<br/>
 +
<br/><br/><br/>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
</body>
 +
</html>

Latest revision as of 03:38, 20 October 2016