<a href="#exp1"> <h4>Growth of bacteria </h4></a></br>  

     <p><h5><B>September 7, 2016:</B></h5></p>

         <a href="#exp2"><h4> Purification of the protein </h4></a></br>  

           <a href="#exp3"><h4> Protein gel on SDS-Page </h4></a></br>  

           <a href="#exp4"><h4> Harvest the culture with Miniprep </h4></a></br>

           <a href="#exp5"><h4> Extraction of plasmid DNA </h4></a></br>  

           <a href="#exp6"><h4> Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>

               <U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.</br> </br>  

 

              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>

                   &bull; 2 2L erlenmeyers</br>  

                   &bull; LB (lysogeny Luria broth)</br>  

                   &bull; IPTG (0.1M)</br>  

                   &bull; Precultures in 25ml erlenmeyers</br>  

                   &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)</br> </br>  

                   Put 1L of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150RPM</br>  

                   Once warmed, add 12.5ml of preculture in each erlenmeyer</br>  

                   Let grow in the shaking incubator.</br>  

                   Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min</br> </br>  

                             <th>C2(1)</th>

                             <th>C2(2)</th>

                             <td><strong><p>10:30AM</p></strong></td>

                             <td>0</td>

                             <td>0 </td>

                             <td><strong><p>01:55PM</p></strong></td>

                             <td>0.438</td>

                             <td>/</td>

                             <td><strong><p>2:25PM</p></strong></td>

                             <td>0.602</td>

                             <td>0.429 </td>

                             <td><strong><p>2:45PM</p></strong></td>

                             <td>0.679</td>

                             <td>0.600 </td>

                   </table>

                  <center>Optical Density</center></br></br></br>

 

 

                9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.</br> </br>  

 

 

              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>

                 &bull; Chaotropic reagent (Guanidinium 6M) </br>

                 &bull; EDTA 0,1M </br>

                 &bull; PMSF (100mM) </br>

                 &bull; Ni 2+ solution (100mM) </br>

                 &bull; Centrifuge (labo deshmukh) </br>

                 &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl) </br>

                 &bull; Buffer B (50mM Tris, 150mM of NaCl, 250mM Imidazole, pH=7.4) </br> </br>

                Melt the pellet of bacteria C2 (from 1L culture) and resuspend it with 10ml of buffer A. We had 25ml of pellet we complete until 40ml with buffer A. </br>

                 Add 40 &#181;L of PMSF to avoid protein denaturation. </br>

                 Put the column on the FPLC, clean the FPLC with water and then fill it with buffer A. </br>

                 Sonicate the sample three times one minute at 60%, wait 90 seconds between each sonication. </br>

                 Centrifuge 25 min at 16000g (rotor JA 25.50) </br>

                 Inject your sample in the FPLC </br>

                 Get back several samples: </br>

                   &bull; C: Crude extract : before centrigugation </br>

                   &bull; P: Pellet </br>

                   &bull; SN: Supernatant </br>

                   &bull; F: Flow through (unfixed proteins) </br>

                   &bull; W: Wash 5% of buffer B </br>

                   &bull; Fractions (depending on the gradient) </br> </br>

               <U> Aim:</U> Get the size of the protein purified thanks to FPLC in order to know if it is our protein </br> </br>

               &bull; SDS-Page cuve </br>

               &bull; SDS-Page gel (BIORAD) </br>

               &bull; Protein migration buffer </br>

               &bull; Protein ladder </br>

               &bull; Laemmli 2X </br>

               &bull; Coomassie Blue </br>

               &bull; Microbiology equipment (Follow this link) </br> </br>

               <U>Method:</U>

              In 9 1.5ml eppendorf, put 20 &#181;L of a sample and 20 &#181;L of Laemmli 2X. </br>

              Let denaturate the proteins 5min at 95°C </br>

               Place the gel into the cuve and fill it with migration buffer </br>

               Follow the next deposit table: </br>

                &bull; Fraction 13 </br>

                &bull; Fraction 15 </br>

                &bull; Fraction 17 </br>

                &bull; Fraction 19 </br>

                &bull; Fraction 21 </br>

                &bull; Fraction 23 </br>

                &bull; Fraction 25 </br>

                &bull; Fraction 27 </br>

                &bull; Protein gene ruler (8 &#181;L) </br>

               4. Launch the migration at 130V. </br>

               5. Wash the gel three times with distilled water during 5min. </br>

               6. Color the gel with Coomassie Blue diluted 1/5 during 30min. </br>

               7. Wash with distilled water for 5min then let wash 15min.

               </br> </br>

               <U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 </br>

                 In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.</br> </br>

               <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>

               <U>What we did in the lab:</U></br>

               <U>Materials:</U></br>

                 &bull; Microbiology equipement </br>

                 &bull; 15 mL Falcons </br>

                 &bull; Carbenicillin 50 mg/ml </br>

                 &bull; LB medium </br> </br>

                 <U>Method:</U></br>

                 One colony is picked from the plates and shaken in 5.0 mL of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml. </br>

                 The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight. </br> </br>

               <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1a with the inserts A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 from cultures made on the 8/09. </br> The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep. </br>

 

              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>

               <U>What we did in the lab:</U></br>

               <U>Materials:</U></br>

               &bull; 50 ml Falcon tube </br>

               &bull; Shaking incubator (INFORS HT) </br>

               &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41) </br>

               &bull; QIAGEN Miniprep kit </br>

               &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this link) </br> </br>

 

            <U>Method:</U></br>

              The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below. </br> </br>

 

 

            Follow QIAGEN kit steps. Final volume: 100 &#181;L </br> </br>

               <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) </br> </br>

               <U>What we did in the lab:</U></br>

               <U>Materials:</U></br>

                     &bull; Nanodrop (Thermofisher) </br>

                     &bull; Elution buffer from QIAGEN kit </br>

                     &bull; Microbiology equipment (Follow this link) </br> </br>

                 <U>Method:</U></br>

                 Analyze absorbance at 260nm </br>

                 Clean the Nanodrop with water </br>  

                 Make the blank with 1ul of elution buffer </br>

                 Put 1ul of your sample on the Nanodrop </br>

                 Make the measure and clean the Nanodrop between each measure </br> </br>

                 <U>Results:</U></br>

                             <th>A260</th>

                             <th>A280</th>

                             <th>A260/280</th>

                             <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>

                             <td><strong><p>A1</p></strong></td>

                             <td>0.645</td>

                             <td>0.345</td>

                             <td>1.87</td>

                             <td>32.3</td>

                             <td><strong><p>A1’ _{(diluted 1/2)}</p></strong></td>

                             <td>1.314</td>

                             <td>0.704</td>

                             <td>1.86 </td>

                             <td>65.7 </td>

                             <td><strong><p>A2_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>1.404</td>

                             <td>0.752</td>

                             <td>1.87 </td>

                             <td>70.2</td>

                             <td><strong><p>A2’_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>0.494</td>

                             <td>0.269</td>

                             <td>1.87</td>

                             <td>24.7</td>

                             <td><strong><p>C1_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>0.305 </td>

                             <td>0.165</td>

                             <td>1.85 </td>

                             <td>15.2 </td>

                             <td><strong><p>C1’_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>0.812 </td>

                             <td>0.445</td>

                             <td>1.83</td>

                             <td>40.6</td>

                             <td><strong><p>C2_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>0.499 </td>

                             <td>0.272</td>

                             <td>1.83</td>

                             <td>24.9 </td>

                             <td><strong><p>C2’_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>0.757 </td>

                             <td>0.402</td>

                             <td>1.88</td>

                             <td>37.8</td>

                             <td><strong><p>D1_{(diluted 1/4)}</p></strong></td>

                             <td>0.441 </td>

                             <td>0.233</td>

                             <td>1.89</td>

                             <td>22.1 </td>

                             <td><strong><p>D1’_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>0.725</td>

                             <td>0.396</td>

                             <td>1.83</td>

                             <td>36.3</td>

                             <td><strong><p>D2_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>0.264 </td>

                             <td>0.141</td>

                             <td>1.87</td>

                             <td>13.2</td>

                             <td><strong><p>D2’_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>0.418 </td>

                             <td>0.216</td>

                             <td>1.94</td>

                             <td>20.9 </td>

                             <td><strong><p>E1_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>0.487 </td>

                             <td>0.266</td>

                             <td>1.83</td>

                             <td>24.3</td>

                             <td><strong><p>E1’_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>0.478 </td>

                             <td>0.247</td>

                             <td>1.94</td>

                             <td>24.0</td>

                             <td><strong><p>E2_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>1.364</td>

                             <td>0.742</td>

                             <td>1.84</td>

                             <td>68.2</td>

                             <td><strong><p>E2’_{(diluted 1/4)})</p></strong></td>

                             <td>1.041 </td>

                             <td>0.562</td>

                             <td>1.85</td>

                             <td>52.1</td>

                   </table>

                  <center>Absorbance</center></br></br></br>