Difference between revisions of "Team:NKU China/Notebook"

Line 10: Line 10:
 
     <style>
 
     <style>
 
         main#notebook {
 
         main#notebook {
 +
            font-size:16px;
 
             margin: auto;
 
             margin: auto;
 
             width: 80%;
 
             width: 80%;
 
             box-sizing: border-box;
 
             box-sizing: border-box;
 
             padding: 10px;
 
             padding: 10px;
 +
        }
 +
 +
        @media all and (min-width: 1601px) {
 +
            main#notebook {
 +
                font-size: 20px;
 +
            }
 +
        }
 +
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-header {
 +
            font-size:14px;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-header h2 {
 +
         
 +
            margin:0px;
 +
            padding-bottom:5px;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-content {
 +
            font-size:18px;
 +
            padding:15px 30px;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-content p{
 +
            margin-top:0px;
 +
            margin-bottom:10px;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-content table{
 +
            border-spacing:0px;
 +
            width:49%;
 +
            display:inline-block;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-content table td{
 +
            padding:5px;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-content table tr:last-child td{
 +
            border-bottom:1px solid;
 +
        }
 +
 +
        #accordion .ui-accordion-content table caption{
 +
            border-top:1px solid;
 +
            border-bottom:1px solid;
 +
            width:100%;
 
         }
 
         }
  
 
         .tabs .ui-tabs-nav {
 
         .tabs .ui-tabs-nav {
−
             /*font-size : 120%;*/
+
             font-size:25px;
 +
        }
 +
 
 +
        .tabs .ui-tabs-nav .ui-tabs-anchor{
 +
            padding:8px 15px;
 +
        }
 +
 
 +
        /*PCR system*/
 +
        .table-theme-1 {         
 +
            color:rgb(49,132,155);
 
         }
 
         }
  
−
         #accordion {
+
         .table-theme-1 caption {          
−
             font-size: 100%;
+
             border-top-color: rgb(75,172,198);
 +
            border-bottom-color: rgb(75,172,198);          
 
         }
 
         }
  
−
         #accordion p {
+
         .table-theme-1 table tr:last-child td{
−
             font-size: 100%;
+
             border-bottom-color:rgb(75,172,198);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-1 tr:nth-child(odd) {
 +
            background-color: rgb(210,234,241);           
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-1 tr:nth-child(even) {
 +
     
 +
        }
 +
 
 +
        /*PCR reaction condition*/
 +
        .table-theme-2 {
 +
            color:rgb(118,146,60);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-2 caption {         
 +
            border-top-color: rgb(155, 187, 89);
 +
            border-bottom-color: rgb(155, 187, 89);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-2 table tr:last-child td{
 +
            border-bottom-color:rgb(75,172,198);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-2 tr:nth-child(odd) {
 +
            background-color: rgb(230,238,213);           
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-2 tr:nth-child(even) {
 +
     
 +
        }
 +
 
 +
        /*ligation system*/
 +
        .table-theme-3 {
 +
            color:rgb(95, 73, 122);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-3 caption {         
 +
            border-top-color: rgb(128, 100, 162);
 +
            border-bottom-color: rgb(128, 100, 162);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-3 table tr:last-child td{
 +
            border-bottom-color:rgb(128, 100, 162);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-3 tr:nth-child(odd) {
 +
            background-color: rgb(223, 215, 232);           
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-3 tr:nth-child(even) {
 +
     
 +
        }
 +
 
 +
        /*digestion system*/
 +
        .table-theme-4{
 +
            color:rgb(148, 54, 52);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-4 caption {         
 +
            border-top-color: rgb(192, 80, 77);
 +
            border-bottom-color: rgb(192, 80, 77);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-4 table tr:last-child td{
 +
            border-bottom-color:rgb(192, 80, 77);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-4 tr:nth-child(odd) {
 +
            background-color: rgb(239, 211, 210);           
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-4 tr:nth-child(even) {
 +
     
 +
        }
 +
 
 +
        /*methylation  system*/
 +
        .table-theme-5{
 +
            color:rgb(227, 108, 10);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-5 caption {         
 +
            border-top-color: rgb(247, 150, 70);
 +
            border-bottom-color: rgb(247, 150, 70);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-5 table tr:last-child td{
 +
            border-bottom-color:rgb(247, 150, 70);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-5 tr:nth-child(odd) {
 +
            background-color: rgb(253, 228, 208);           
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-5 tr:nth-child(even) {
 +
     
 +
        }
 +
 
 +
        /*Groups divided*/
 +
        .table-theme-6{
 +
            color:rgb(0, 0, 0);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-6 caption {         
 +
            border-top-color: rgb(0, 0, 0);
 +
            border-bottom-color: rgb(0, 0, 0);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-6 table tr:last-child td{
 +
            border-bottom-color:rgb(0, 0, 0);
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-6 tr:nth-child(odd) {
 +
            background-color: rgb(192, 192, 192);           
 +
        }
 +
 
 +
        .table-theme-6 tr:nth-child(even) {
 +
     
 
         }
 
         }
 
     </style>  
 
     </style>  
Line 35: Line 211:
 
             $("#accordion").accordion({
 
             $("#accordion").accordion({
 
                 header: "header",
 
                 header: "header",
−
                 event: 'mouseover'
+
                 event: 'click',
 +
                heightStyle: 'content',
 +
                collapsible: true,
 +
                active: false,
 
             });
 
             });
 
              
 
              
Line 41: Line 220:
 
                 function (index, value) {
 
                 function (index, value) {
 
                     $(value).tabs({
 
                     $(value).tabs({
−
                         event: "mouseover"
+
                         event: "mouseover",
 +
                        heightStyle: 'content'
 
                     });
 
                     });
 
                 }
 
                 }
−
             )
+
             )                            
−
 
+
−
               
+
−
           
+
−
               
+
 
         });
 
         });
 
     </script>  
 
     </script>  
Line 54: Line 230:
  
 
<body>
 
<body>
−
     hello
+
     <div style="display:none">
 +
        <table class="table-theme-1" id="table5-1-1">
 +
            <caption>50&mu;L PCR system X2</caption>
 +
            <tr>
 +
                <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                <td>25&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>C2-F</td>
 +
                <td>2&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>C2-R</td>
 +
                <td>2&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>p-C2</td>
 +
                <td>2&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>ddH2O</td>
 +
                <td>19&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>Total</td>
 +
                <td>50&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
        </table>
 +
        <table class="table-theme-2" id="table5-1-2">
 +
            <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
            <tr>
 +
                <td>94&#8451;</td>
 +
                <td>10 min</td>
 +
                <td></td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>94&#8451;</td>
 +
                <td>30 sec</td>
 +
                <td></td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>58&#8451;</td>
 +
                <td>15 sec</td>
 +
                <td>30 cycles</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>72&#8451;</td>
 +
                <td>30 sec</td>
 +
                <td></td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>72&#8451;</td>
 +
                <td>10 min</td>
 +
                <td></td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>16&#8451;</td>
 +
                <td>&infin;</td>
 +
                <td></td>
 +
            </tr>
 +
        </table>
 +
        <table class="table-theme-3" id="table5-2-3">
 +
            <caption>20&mu;L ligation system</caption>
 +
            <tr>
 +
                <td>10X DNA Ligase Buffer</td>
 +
                <td>2&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>T4 DNA Ligase</td>
 +
                <td>1&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pMD19 T-Simple Vector</td>
 +
                <td>1&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td><i>C2-luxS</i></td>
 +
                <td>4&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>ddH2O</td>
 +
                <td>12&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>Total</td>
 +
                <td>20&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td colspan="2">Reaction condition: 16&#8451; overnight</td>
 +
            </tr>
 +
        </table>
 +
        <table class="table-theme-4" id="table5-4-1">
 +
            <caption>20&mu;L digestion  system</caption>
 +
            <tr>
 +
                <td>10X FastDigest Buffer</td>
 +
                <td>2&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>BamH &#8544;</td>
 +
                <td>1&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>T-<i>lsrACDB</i></td>
 +
                <td>1&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>ddH2O</td>
 +
                <td>7&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>Total</td>
 +
                <td>20&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td colspan="2">Reaction condition: 37&#8451; for 40 min</td>
 +
            </tr>
 +
        </table>
 +
        <table class="table-theme-5" id="table6-4-1">
 +
            <caption>100&mu;L methylation  system</caption>
 +
            <tr>
 +
                <td>10X BamH &#8544; methyltransferase Buffer</td>
 +
                <td>10&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>BamH &#8544; methyltransferase</td>
 +
                <td>1&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>S-adenosylmethionine</td>
 +
                <td>0.5&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pWH-<i>C2-luxS</i></td>
 +
                <td>80&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>ddH2O</td>
 +
                <td>8.5&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>Total</td>
 +
                <td>100&mu;L</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td colspan="2">Reaction condition: 37&#8451; for 1 hour</td>
 +
            </tr>
 +
        </table>
 +
        <table class="table-theme-6" id="table12-1-1">
 +
            <caption>Groups divided in this experiment</caption>
 +
            <tr>
 +
                <td>GR286</td>
 +
                <td>wild strain as control group</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>GR286&Delta;<i>luxS</i></td>
 +
                <td>GR286 without <i>luxS</i> gene</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pWH-<i>luxS</i></td>
 +
                <td><i>luxS</i> overexpression plasmid in GR286; without induced by xylose</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pWH-<i>luxS</i> + xyl</td>
 +
                <td><i>luxS</i> overexpression plasmid in GR286; induced by xylose</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pWH1520</td>
 +
                <td>empty plasmid in GR286 as control group</td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pHT-<i>lsrACDB</i></td>
 +
                <td><i>lsrACDB</i> overexpression plasmid in GR286&Delta;<i>luxS</i></td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>pHT-01</td>
 +
                <td>empty plasmid in GR286&Delta;<i>luxS</i> as control group</td>
 +
            </tr>
 +
        </table>
 +
        <figure>
 +
            <img src="image/notebook/notebook-6-13-1.png" width="347" height="284">
 +
            <figcaption>
 +
                Selecting positive clones by colony PCR<br>
 +
                (No.1 is positive control, No.2-6 are experimental groups. The result showed that we failed to transformed the plasmid pWH-<i>C2-luxS</i> into GR286)
 +
            </figcaption>
 +
        </figure>
 +
    </div>
 
     <main id="notebook">
 
     <main id="notebook">
 
         <h1>Notebook</h1>
 
         <h1>Notebook</h1>
 
          
 
          
 
         <div id="accordion">
 
         <div id="accordion">
−
             <article>
+
             <article id="week1">
 
                 <header>
 
                 <header>
−
                     Week1
+
                     <h2>Week1</h2>
 
                 </header>
 
                 </header>
 
                 <div class="article-body">
 
                 <div class="article-body">
 
                     <p>
 
                     <p>
−
                         In order to make sure our "consumer" efficient, we should first knock out the luxS gene in our engineering bacteria GR286(a simplified strain of Bacillus amyloliquefaciens LL3). We used a markerless gene replacement method  to knock out the luxS gene.
+
                         In order to make sure our "consumer" efficient, we should first knock out the <i>luxS</i> gene in our engineering bacteria GR286(a simplified strain of <i>Bacillus amyloliquefaciens</i> LL3). We used a markerless gene replacement method  to knock out the <i>luxS</i> gene.
 
                     </p>
 
                     </p>
 
                     <div class="tabs" id="tabs1">
 
                     <div class="tabs" id="tabs1">
Line 75: Line 436:
 
                         <div id="fragment1-1">
 
                         <div id="fragment1-1">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 Construction of targeting vector : the upstream and downstream of luxS gene were combined by over-lapping PCR and ligated into plasmid pKSU.
+
                                 Construction of targeting vector : the upstream and downstream of <i>luxS</i> gene were combined by over-lapping PCR and ligated into plasmid pKSU.
−
                             </p>
+
                             </p>                          
−
                           
+
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                         <div id="fragment1-2">
 
                         <div id="fragment1-2">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 Transformed pKSU-&#8710;luxS into GR286, and selected out positive clones.
+
                                 Transformed pKSU-&Delta;<i>luxS</i> into GR286, and selected out positive clones.
 
                             </p>
 
                             </p>
−
                              
+
                             <table class="table-theme-1" id="table1-2-1">
 +
                                <caption>20&mu;L PCR system</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                    <td>10&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>pKSU-F</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>pKSU-R</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Bacterium solution</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>ddH2O</td>
 +
                                    <td>7&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Total</td>
 +
                                    <td>20&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <table class="table-theme-2" id="table1-2-2">
 +
                                <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>58&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td>30 cycles</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>1 min 30 sec</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>16&#8451;</td>
 +
                                    <td>&infin;</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <figure>
 +
                                <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/e/e9/T--NKU_China--notebook-1-5-1.png" width="330" height="291">
 +
                                <figcaption>Selecting positive clones by PCR</figcaption>
 +
                            </figure>
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                         <div id="fragment1-3">
 
                         <div id="fragment1-3">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 The transformants were cultured at 42<U+00A1><e6> with chloramphenicol to select single-crossover clones.
+
                                 The transformants were cultured at 42&#8451; with chloramphenicol to select single-crossover clones.
−
                             </p>               
+
                             </p>
 +
                            <table class="table-theme-1" id="table1-3-1">
 +
                                <caption>20&mu;L PCR system</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                    <td>10&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-up-F</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-dn-R</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Bacterium solution</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>ddH2O</td>
 +
                                    <td>7&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Total</td>
 +
                                    <td>20&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <table class="table-theme-2" id="table1-3-2">
 +
                                <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>56&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td>30 cycles</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>2 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>16&#8451;</td>
 +
                                    <td>&infin;</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <figure>
 +
                                <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/d/de/T--NKU_China--notebook-1-5-2.jpeg" width="466" height="375">
 +
                                <figcaption>
 +
                                    Selecting single-crossover clones using PCR<br>
 +
                                    (No.1-4 are single-crossover strains, No.5 is positive control.)
 +
                                </figcaption>
 +
                            </figure>               
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </article>
 
             </article>
−
             <article>
+
             <article id="week2">
 
                 <header>
 
                 <header>
−
                     Week2
+
                     <h2>Week2</h2>
 
                 </header>
 
                 </header>
 
                 <div class="article-body">
 
                 <div class="article-body">
Line 106: Line 596:
 
                             <p>
 
                             <p>
 
                                 The single-crossover strains were then cultured at LB medium and passaged every 12 hours for 4 generation.
 
                                 The single-crossover strains were then cultured at LB medium and passaged every 12 hours for 4 generation.
−
                             </p>
+
                             </p>                            
−
 
+
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                         <div id="fragment2-2">
 
                         <div id="fragment2-2">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 Cultured the last generation at medium with 5-fluorouracil to select double-crossover clones. Regretfully, we didn<U+00A1><U+00AF>t get the double-crossover clones.
+
                                 Cultured the last generation at medium with 5-fluorouracil to select double-crossover clones. Regretfully, we didn&#39;t get the double-crossover clones.
 
                             </p>
 
                             </p>
−
 
+
                            <table class="table-theme-1" id="table2-2-1">
 +
                                <caption>20&mu;L PCR system</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                    <td>10&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-up-F</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-dn-R</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Bacterium solution</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>ddH2O</td>
 +
                                    <td>7&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Total</td>
 +
                                    <td>20&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <table class="table-theme-2" id="table2-2-2">
 +
                                <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>56&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td>30 cycles</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>2 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>16&#8451;</td>
 +
                                    <td>&infin;</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <figure>
 +
                                <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/3/3d/T--NKU_China--notebook-1-5-3.png" width="341" height="292">
 +
                                <figcaption>
 +
                                    Selecting double-crossover clones using PCR<br>
 +
                                    (No.1-5 are experimental groups, No.6 is wild GR286.The result showed that we failed to get the double-crossover clones.)
 +
                                </figcaption>
 +
                            </figure>
 
                         </div>                 
 
                         </div>                 
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </article>
 
             </article>
−
             <article>
+
             <article id="week3">
 
                 <header>
 
                 <header>
−
                     Week3
+
                     <h2>Week3</h2>
 
                 </header>
 
                 </header>
 
                 <div class="article-body">
 
                 <div class="article-body">
Line 131: Line 686:
 
                         <div id="fragment3-1">
 
                         <div id="fragment3-1">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 We cultured transformants at 42<U+00A1><e6> with chloramphenicol again and selected the  single-crossover clones successfully.
+
                                 We cultured transformants at 42&#8451; with chloramphenicol again and selected the  single-crossover clones successfully.
 
                             </p>
 
                             </p>
−
 
+
                            <table class="table-theme-1" id="table3-1-1">
 +
                                <caption>20&mu;L PCR system</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                    <td>10&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-up-F</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-dn-R</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Bacterium solution</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>ddH2O</td>
 +
                                    <td>7&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Total</td>
 +
                                    <td>20&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <table class="table-theme-2" id="table3-1-2">
 +
                                <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>56&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td>30 cycles</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>2 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>16&#8451;</td>
 +
                                    <td>&infin;</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <figure>
 +
                                <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/9/93/T--NKU_China--notebook-1-5-4.png" width="350" height="292">
 +
                                <figcaption>
 +
                                    Selecting single-crossover clones using PCR<br>
 +
                                    (No.1&amp;2&amp;4 are single-crossover strains,No.5 is positive control. )
 +
                                </figcaption>
 +
                            </figure> 
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                         <div id="fragment3-2">
 
                         <div id="fragment3-2">
Line 139: Line 760:
 
                                 The single-crossover strains were then cultured at LB medium and passaged every 12 hours for 4 generations.
 
                                 The single-crossover strains were then cultured at LB medium and passaged every 12 hours for 4 generations.
 
                             </p>
 
                             </p>
−
 
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                         <div id="fragment3-3">
 
                         <div id="fragment3-3">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 Cultured the last generation at medium with 5-fluorouracil to select double-crossover clones. We finally got our aimed strain<U+00A1><U+00AA>GR286&#8710;luxS.
+
                                 Cultured the last generation at medium with 5-fluorouracil to select double-crossover clones. We finally got our aimed strain&#8212;GR286&Delta;<i>luxS</i>.
 
                             </p>
 
                             </p>
 +
                            <table class="table-theme-1" id="table3-3-1">
 +
                                <caption>20&mu;L PCR system</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                    <td>10&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-up-F</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td><i>luxS</i>-dn-R</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Bacterium solution</td>
 +
                                    <td>1&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>ddH2O</td>
 +
                                    <td>7&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Total</td>
 +
                                    <td>20&mu;L</td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <table class="table-theme-2" id="table3-3-2">
 +
                                <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>94&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>56&#8451;</td>
 +
                                    <td>30 sec</td>
 +
                                    <td>30 cycles</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>2 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>72&#8451;</td>
 +
                                    <td>10 min</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>16&#8451;</td>
 +
                                    <td>&infin;</td>
 +
                                    <td></td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                            <figure>
 +
                                <img src="image/notebook/notebook-1-5-5.png" width="254" height="209">
 +
                                <figcaption>
 +
                                    Selecting the strain lacking of <i>luxS</i> gene using PCR<br>
 +
                                    (The No.4 is the aimed strain<U+00A1><U+00AA>GR286&Delta;<i>luxS</i>)
 +
                                </figcaption>
 +
                            </figure> 
 
                         </div>
 
                         </div>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </article>
 
             </article>
−
             <article>
+
             <article id="week4">
 
                 <header>
 
                 <header>
−
                     Week4
+
                     <h2>Week4</h2>
 
                 </header>
 
                 </header>
 
                 <div class="tabs" id="tabs4">
 
                 <div class="tabs" id="tabs4">
Line 160: Line 847:
 
                         <li><a href="#fragment4-4">&#10115;</a></li>
 
                         <li><a href="#fragment4-4">&#10115;</a></li>
 
                         <li><a href="#fragment4-5">&#10116;</a></li>
 
                         <li><a href="#fragment4-5">&#10116;</a></li>
 +
                        <li><a href="#fragment4-6">&#10117;</a></li>
 
                     </ul>
 
                     </ul>
 
                     <div id="fragment4-1">
 
                     <div id="fragment4-1">
 
                         <p>
 
                         <p>
−
                             Cultured the GR286<U+00A6><U+00A4>luxS strain and made it competence for future use.
+
                             Cultured the GR286&Delta;<i>luxS</i> strain and made it competence for future use.
 
                         </p>
 
                         </p>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div id="fragment4-2">
 
                     <div id="fragment4-2">
 
                         <p>
 
                         <p>
−
                             Cloned the lsrACDB gene from Bacillus thuringiensis and ligated it to T-vector.
+
                             Cloned the <i>lsrACDB</i> gene from <i>Bacillus thuringiensis</i> and ligated it to T-vector.
 
                         </p>
 
                         </p>
 +
                        <table class="table-theme-1" id="table4-2-1">
 +
                            <caption>50&mu;L PCR system X2</caption>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                <td>25&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td><i>lsrACDB</i>-F</td>
 +
                                <td>2&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td><i>lsrACDB</i>-R</td>
 +
                                <td>2&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>Bacterium solution</td>
 +
                                <td>2&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>ddH2O</td>
 +
                                <td>19&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>Total</td>
 +
                                <td>50&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                        </table>
 +
                        <table class="table-theme-2" id="table4-2-2">
 +
                            <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>94&#8451;</td>
 +
                                <td>10 min</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>94&#8451;</td>
 +
                                <td>30 sec</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>57&#8451;</td>
 +
                                <td>30 sec</td>
 +
                                <td>30 cycles</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>72&#8451;</td>
 +
                                <td>4 min 30 sec</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>72&#8451;</td>
 +
                                <td>10 min</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>16&#8451;</td>
 +
                                <td>&infin;</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                        </table>
 +
                        <table class="table-theme-3" id="table4-2-3">
 +
                            <caption>20&mu;L ligation system</caption>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>10X DNA Ligase Buffer</td>
 +
                                <td>2&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>T4 DNA Ligase</td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>pMD19 T-Simple Vector</td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td><i>lsrACDB</i></td>
 +
                                <td>3&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>ddH2O</td>
 +
                                <td>13&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>Total</td>
 +
                                <td>20&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td colspan="2">Reaction condition: 16&#8451; overnight</td>
 +
                            </tr>
 +
                        </table>                     
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div id="fragment4-3">
 
                     <div id="fragment4-3">
 
                         <p>
 
                         <p>
−
                             Transformed the T-lsrACDB into DH5a. Selected positive clones and sent them to sequencing. Unfortunately, the sequencing result showed some mutations in cloning gene.
+
                             Transformed the T-<i>lsrACDB</i> into DH5&alpha; and coated plate, and then selected positive clones by colony PCR.
 
                         </p>
 
                         </p>
 +
                        <table class="table-theme-1" id="table4-3-1">
 +
                            <caption>20&mu;L PCR system</caption>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>2X Taq Master Mix</td>
 +
                                <td>10&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>M13F</td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>M13R</td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>Bacterium solution</td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>ddH2O</td>
 +
                                <td>7&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>Total</td>
 +
                                <td>20&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                        </table>
 +
                        <table class="table-theme-2" id="table4-3-2">
 +
                            <caption>PCR reaction condition</caption>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>94&#8451;</td>
 +
                                <td>10 min</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>94&#8451;</td>
 +
                                <td>30 sec</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>59&#8451;</td>
 +
                                <td>30 sec</td>
 +
                                <td>30 cycles</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>72&#8451;</td>
 +
                                <td>4 min 30 sec</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>72&#8451;</td>
 +
                                <td>10 min</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>16&#8451;</td>
 +
                                <td>&infin;</td>
 +
                                <td></td>
 +
                            </tr>
 +
                        </table>
 +
                        <figure>
 +
                            <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/7/72/T--NKU_China--notebook-1-5-6.png" width="215" height="180">
 +
                            <figcaption>
 +
                                Selecting positive clones by PCR<br>
 +
                                (No. 3&amp;4 are positive results)
 +
                            </figcaption>
 +
                        </figure>                     
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div id="fragment4-4">
 
                     <div id="fragment4-4">
 
                         <p>
 
                         <p>
−
                             We repeated the process of gene cloning but there were still some mutations.
+
                             After restriction enzyme digestion verification, we sent them to sequencing. Unfortunately, the sequencing result showed some mutations in cloning gene.
 
                         </p>
 
                         </p>
 +
                        <table class="table-theme-4" id="table4-4-1">
 +
                            <caption>20&mu;L digestion  system</caption>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>10X FastDigest Buffer</td>
 +
                                <td>2&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>BamH &#8544;</td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>T-<i>lsrACDB</i></td>
 +
                                <td>1&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>ddH2O</td>
 +
                                <td>7&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td>Total</td>
 +
                                <td>20&mu;L</td>
 +
                            </tr>
 +
                            <tr>
 +
                                <td colspan="2">Reaction condition: 37&#8451; for 40 min</td>
 +
                            </tr>
 +
                        </table>
 +
                        <figure>
 +
                            <img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/9/91/T--NKU_China--notebook-1-5-7.png" width="201" height="322">
 +
                            <figcaption>
 +
                                Restriction enzyme digestion verification<br>
 +
                                (No.1 are <i>lsrACDB</i> fragement, No.2 are linearized T-vector.)
 +
                            </figcaption>
 +
                        </figure>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div id="fragment4-5">
 
                     <div id="fragment4-5">
 +
                        <p>
 +
                            We repeated the process of gene cloning but there were still some mutations.
 +
                        </p>
 +
                    </div>
 +
                    <div id="fragment4-6">
 
                         <p>
 
                         <p>
 
                             We finally decided to request the gene company to synthesize the lsrACDB gene.
 
                             We finally decided to request the gene company to synthesize the lsrACDB gene.
Line 188: Line 1,071:
 
                 </div>
 
                 </div>
 
             </article>
 
             </article>
−
             <article>
+
             <article id="week5">
 
                 <header>
 
                 <header>
−
                     Week5
+
                     <h2>Week5</h2>
 
                 </header>
 
                 </header>
 
                 <div class="article-body">
 
                 <div class="article-body">
 
                     <p>
 
                     <p>
−
                         This week, we started to construct another controller<U+00A1><U+00AA>supplier.
+
                         This week, we started to construct another controller&#8213;supplier.
 
                     </p>
 
                     </p>
 
                     <div class="tabs" id="tabs5">
 
                     <div class="tabs" id="tabs5">
Line 205: Line 1,088:
 
                         <div id="fragment5-1">
 
                         <div id="fragment5-1">
 
                             <p>
 
                             <p>
−
                                 We cloned a strong promoter C2 from former kit and cloned luxS gene from GR286.
+
                                 We cloned a strong promoter <i>C2</i> from former kit and cloned <i>luxS</i> gene from GR286.
 
                             </p>
 
                             </p>
−
 
+
                            <table class="table-theme-1" id="table5-1-1">
−
                        </div>
+
                                <caption>50&mu;L PCR system X2</caption>
−
                        <div id="fragment5-2">
+
                                 <tr>
−
                            <p>
+
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
−
                                Fuse the two segments together by fusion PCR, and ligated it into T-vector. Then, transformed the vector into DH5a.
+
                                    <td>25&mu;L</td>
−
                            </p>
+
                                </tr>
−
 
+
                                <tr>
−
                        </div>
+
                                    <td>C2-F</td>
−
                        <div id="fragment5-3">
+
                                    <td>2&mu;L</td>
−
                            <p>
+
                                </tr>
−
                                Selected the positive clones by colony PCR.
+
                                <tr>
−
                            </p>
+
                                    <td>C2-R</td>
−
                        </div>
+
                                    <td>2&mu;L</td>
−
                        <div id="fragment5-4">
+
                                </tr>
−
                            <p>
+
                                <tr>
−
                                 We chose 4 positive strains to culture overnight and extracted the plasmid. After restriction enzyme digestion verification, we sent them to sequencing.
+
                                    <td>p-C2</td>
−
                            </p>
+
                                    <td>2&mu;L</td>
−
                        </div>
+
                                 </tr>
−
                    </div>
+
                                 <tr>
−
                </div>
+
                                    <td>ddH2O</td>
−
            </article>
+
                                    <td>19&mu;L</td>
−
            <article>
+
                                 </tr>
−
                <header>
+
                                <tr>
−
                    Week6
+
                                    <td>Total</td>
−
                </header>
+
                                    <td>50&mu;L</td>
−
                <div class="article-body">
+
                                </tr>
−
                    <div class="tabs" id="tabs6">
+
                             </table>
−
                        <ul>
+
                             <table class="table-theme-2" id="table5-1-2">
−
                            <li><a href="#fragment6-1">&#10112;</a></li>
+
                                 <caption>PCR reaction condition</caption>
−
                            <li><a href="#fragment6-2">&#10113;</a></li>
+
                                <tr>
−
                            <li><a href="#fragment6-3">&#10114;</a></li>
+
                                    <td>94&#8451;</td>
−
                            <li><a href="#fragment6-4">&#10115;</a></li>
+
                                    <td>10 min</td>
−
                            <li><a href="#fragment6-5">&#10116;</a></li>
+
                                    <td></td>
−
                        </ul>
+
                                </tr>
−
                        <div id="fragment6-1">
+
                                <tr>
−
                            <p>
+
                                    <td>94&#8451;</td>
−
                                The sequencing result showed there<U+00A1><U+00AF>s a correct strain. So we can use the strain for the following experiment. We obtained the correct plasmid T-C2-luxS from DH5a. Then we got the fragment C2-luxS by digestion and gel extraction.
+
                                    <td>30 sec</td>
−
                            </p>
+
                                    <td></td>
−
 
+
                                </tr>
−
                        </div>
+
                                <tr>
−
                        <div id="fragment6-2">
+
                                    <td>58&#8451;</td>
−
                            <p>
+
                                    <td>15 sec</td>
−
                                Ligated the C2-luxS to linearized plasmid pWH1520, and transformed it into DH5a.
+
                                    <td>30 cycles</td>
−
                            </p>
+
                                 </tr>
−
 
+
                                <tr>
−
                        </div>
+
                                    <td>72&#8451;</td>
−
                        <div id="fragment6-3">
+
                                    <td>30 sec</td>
−
                            <p>
+
                                    <td></td>
−
                                 Extracted the plasmid pWH-C2-luxS from DH5a. To prevent the plasmid from DAM&DCM methylation, we transformed it into E.coli JM110.
+
                                 </tr>
−
                            </p>
+
                                <tr>
−
                        </div>
+
                                    <td>72&#8451;</td>
−
                        <div id="fragment6-4">
+
                                    <td>10 min</td>
−
                            <p>
+
                                    <td></td>
−
                                 Extracted the plasmid pWH-C2-luxS from JM110,and dealt with it by BamH<U+00A2><f1>methylase.
+
                                </tr>
−
                            </p>
+
                                <tr>
−
                        </div>
+
                                    <td>16&#8451;</td>
−
                        <div id="fragment6-5">
+
                                    <td>&infin;</td>
−
                            <p>
+
                                    <td></td>
−
                                 Transformed the plasmid into GR286 by electroporation.[Failed]
+
                                </tr>
−
                            </p>
+
                            </table>
−
                        </div>
+
                            <table class="table-theme-1" id="table5-1-3">
−
                    </div>
+
                                 <caption>50&mu;L PCR system X2</caption>
−
                </div>
+
                                 <tr>
−
            </article>
+
                                    <td>2X Taq Master Mix</td>
−
            <article>
+
                                    <td>25&mu;L</td>
−
                <header>
+
                                </tr>
−
                    Week7
+
                                <tr>
−
                </header>
+
                                    <td><i>luxS</i>-F</td>
−
                <div class="article-body">
+
                                    <td>2&mu;L</td>
−
                    <div class="tabs" id="tabs7">
+
                                </tr>
−
                        <ul>
+
                                <tr>
−
                            <li><a href="#fragment7-1">&#10112;</a></li>
+
                                    <td><i>luxS</i>-R</td>
−
                             <li><a href="#fragment7-2">&#10113;</a></li>
+
                                    <td>2&mu;L</td>
−
                             <li><a href="#fragment7-3">&#10114;</a></li>     
+
                                </tr>
−
                        </ul>
+
                                <tr>
−
                        <div id="fragment7-1">
+
                                    <td>Bacterium solution</td>
−
                            <p>
+
                                    <td>1&mu;L</td>
−
                                This week, we tried to use different voltages to transform the plasmid. Sadly, all of these tries got bad results.
+
                                </tr>
−
                            </p>
+
                                <tr>
−
 
+
                                    <td>GR286</td>
−
                        </div>
+
                                    <td>2&mu;L</td>
−
                        <div id="fragment7-2">
+
                                </tr>
−
                            <p>
+
                                 <tr>
−
                                 We considered whether the luxS gene is a little toxic for GR286, and the bacteria tends to refuse the gene when we added a strong promoter in front of it. So, we planned to use induced expression to reconstruction our expression vector.
+
                                    <td>ddH2O</td>
−
                            </p>
+
                                    <td>19&mu;L</td>
−
 
+
                                 </tr>
−
                        </div>
+
                                <tr>
−
                        <div id="fragment7-3">
+
                                    <td>Total</td>
−
                            <p>
+
                                    <td>50&mu;L</td>
−
                                The plasmid pWH1520 contains the strong xylA promoter originating, and transcription from this promoter is xylose inducible. So, the gene of interest carries its own ribosome binding sequence (RBS) and translation initiation codon. Based on these points, we redesigned primers.
+
                                </tr>
−
                            </p>
+
                             </table>
−
                        </div>
+
                             <table class="table-theme-2" id="table5-1-4">
−
                    </div>
+
                                 <caption>PCR reaction condition</caption>
−
                </div>
+
                                 <tr>
−
            </article>
+
                                    <td>94&#8451;</td>
−
            <article>
+
                                    <td>10 min</td>
−
                <header>
+
                                    <td></td>
−
                    Week8
+
                                </tr>
−
                </header>
+
                                <tr>
−
                <div class="article-body">
+
                                    <td>94&#8451;</td>
−
                    <div class="tabs" id="tabs8">
+
                                    <td>30 sec</td>
−
                        <ul>
+
                                    <td></td>
−
                            <li><a href="#fragment8-1">&#10112;</a></li>
+
                                </tr>
−
                            <li><a href="#fragment8-2">&#10113;</a></li>
+
                                <tr>
−
                            <li><a href="#fragment8-3">&#10114;</a></li>
+
                                    <td>59&#8451;</td>
−
                            <li><a href="#fragment8-4">&#10115;</a></li>
+
                                    <td>30 sec</td>
−
                        </ul>
+
                                    <td>30 cycles</td>
−
                        <div id="fragment8-1">
+
                                </tr>
−
                            <p>
+
                                <tr>
−
                                 We cloned luxS gene from GR286 using our new primers.
+
                                    <td>72&#8451;</td>
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment8-2">
+
−
                            <p>
+
−
                                Purified the luxS fragment by gel extraction, and ligated it into linearized pWH1520. Then, transformed the vector into DH5a.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment8-3">
+
−
                            <p>
+
−
                                 Selected the positive clones by colony PCR.
+
−
                            </p>
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment8-4">
+
−
                            <p>
+
−
                                We chose 4 positive strains to culture overnight and extracted the plasmid. After restriction enzyme digestion verification, we sent them to sequencing.
+
−
                            </p>
+
−
                        </div>
+
−
                    </div>
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week9
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                    <div class="tabs" id="tabs9">
+
−
                        <ul>
+
−
                            <li><a href="#fragment9-1">&#10112;</a></li>
+
−
                            <li><a href="#fragment9-2">&#10113;</a></li>
+
−
                            <li><a href="#fragment9-3">&#10114;</a></li>
+
−
                        </ul>
+
−
                        <div id="fragment9-1">
+
−
                            <p>
+
−
                                The sequencing result showed there<U+00A1><U+00AF>s three correct strains. So we can choose a correct strain for the following experiment. We extracted the correct plasmid pWH-luxS from DH5a. To prevent the plasmid from DAM&DCM methylation, we transformed it into E.coli JM110.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment9-2">
+
−
                            <p>
+
−
                                 Extracted the plasmid pWH -luxS from JM110,and dealt with it by BamH<U+00A2><f1>methylase.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment9-3">
+
−
                            <p>
+
−
                                 Transformed the plasmid into GR286 by electroporation, and selected positive clones.
+
−
                            </p>
+
−
                        </div>
+
−
                    </div>
+
−
                    <p>
+
−
                        The construction of supplier was complished!
+
−
                    </p>
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week10
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                    <div class="tabs" id="tabs10">
+
−
                        <ul>
+
−
                            <li><a href="#fragment10-1">&#10112;</a></li>
+
−
                            <li><a href="#fragment10-2">&#10113;</a></li>
+
−
                        </ul>
+
−
                        <div id="fragment10-1">
+
−
                            <p>
+
−
                                Our synthetic lsrACDB gene came back. We first used restriction-ligation method to ligate lsrACDB to plasmid pWH1520, but we failed to select positive after several tries.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment10-2">
+
−
                            <p>
+
−
                                Considering the lsrACDB gene is a large fragment (4500bp), we used ClonExpress technique cloning the gene again to improve the efficiency of ligation. We divided the lsrACDB sequence into two parts and cloned them separately. Then we ligated the two segments to the plasmid pWH1520 and transformed it into DH5a. After that, we used PCR to select the positive clones. However, we didn<U+00A1><U+00AF>t get a good result.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                    </div>
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week11
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                    We learnt a new method called circular polymerase extension cloning (CPEC) for high-throughput cloning of complex and combinatorial DNA libraries, and we decided to use this method to try ligating our lsrACDB gene. It<U+00A1><U+00AF>s encouraging that we succeeded to ligate the lsrACDB gene to the plasmid pHT-01.
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week12
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                    <div class="tabs" id="tabs12">
+
−
                        <ul>
+
−
                            <li><a href="#fragment12-1">&#10112;</a></li>
+
−
                            <li><a href="#fragment12-2">&#10113;</a></li>
+
−
                        </ul>
+
−
                        <div id="fragment12-1">
+
−
                            <p>
+
−
                                 Since we have constructed <U+00A1><U+00B0>supplier<U+00A1><U+00B1> and part of <U+00A1><U+00B0>consumer<U+00A1><U+00B1>, we decided to measure the growth curve to explore the function of our <U+00A1><U+00B0>controller<U+00A1><U+00B1>.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment12-2">
+
−
                            <p>
+
−
                                 Cultured media of our supplier was tested for the presence of AI-2 by inducing luminescence in <i>Vibrio harveyi</i> reporter strain BB170.
+
−
                            </p>
+
−
                        </div>
+
−
                    </div>
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week13
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                    <div class="tabs" id="tabs12">
+
−
                        <ul>
+
−
                             <li><a href="#fragment12-1">&#10112;</a></li>
+
−
                             <li><a href="#fragment12-2">&#10113;</a></li>
+
−
                        </ul>
+
−
                        <div id="fragment12-1">
+
−
                            <p>
+
−
                                 For our consumer, we should also clone the lsrK and lsrFG gene for phosphorylating and degrading AI-2. We used ClonExpress technique cloning the two genes and ligated them to plasmid pHT-01 successfully.
+
−
                            </p>
+
−
 
+
−
                        </div>
+
−
                        <div id="fragment12-2">
+
−
                            <p>
+
−
                                 We cocultured the supplier with BB170 and tested the fluoresent intensity to explore the function of supplier. (negative result)
+
−
                            </p>
+
−
                        </div>
+
−
                    </div>
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week14
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                   
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week15
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                 
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week16
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                   
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week17
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                 
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week18
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                   
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week19
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                   
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
            <article>
+
−
                <header>
+
−
                    Week20
+
−
                </header>
+
−
                <div class="article-body">
+
−
                   
+
−
                </div>
+
−
            </article>
+
−
        </div>
+
−
    </main>
+
−
</body>
+
−
</html>
+

Revision as of 17:05, 19 August 2016

50μL PCR system X2
2X Taq Master Mix 25μL
C2-F 2μL
C2-R 2μL
p-C2 2μL
ddH2O 19μL
Total 50μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
58℃ 15 sec 30 cycles
72℃ 30 sec
72℃ 10 min
16℃ ∞
20μL ligation system
10X DNA Ligase Buffer 2μL
T4 DNA Ligase 1μL
pMD19 T-Simple Vector 1μL
C2-luxS 4μL
ddH2O 12μL
Total 20μL
Reaction condition: 16℃ overnight
20μL digestion system
10X FastDigest Buffer 2μL
BamH Ⅰ 1μL
T-lsrACDB 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
Reaction condition: 37℃ for 40 min
100μL methylation system
10X BamH Ⅰ methyltransferase Buffer 10μL
BamH Ⅰ methyltransferase 1μL
S-adenosylmethionine 0.5μL
pWH-C2-luxS 80μL
ddH2O 8.5μL
Total 100μL
Reaction condition: 37℃ for 1 hour
Groups divided in this experiment
GR286 wild strain as control group
GR286ΔluxS GR286 without luxS gene
pWH-luxS luxS overexpression plasmid in GR286; without induced by xylose
pWH-luxS + xyl luxS overexpression plasmid in GR286; induced by xylose
pWH1520 empty plasmid in GR286 as control group
pHT-lsrACDB lsrACDB overexpression plasmid in GR286ΔluxS
pHT-01 empty plasmid in GR286ΔluxS as control group
Selecting positive clones by colony PCR
(No.1 is positive control, No.2-6 are experimental groups. The result showed that we failed to transformed the plasmid pWH-C2-luxS into GR286)

Notebook

Week1

In order to make sure our "consumer" efficient, we should first knock out the luxS gene in our engineering bacteria GR286(a simplified strain of Bacillus amyloliquefaciens LL3). We used a markerless gene replacement method to knock out the luxS gene.

Construction of targeting vector : the upstream and downstream of luxS gene were combined by over-lapping PCR and ligated into plasmid pKSU.

Transformed pKSU-ΔluxS into GR286, and selected out positive clones.

20μL PCR system
2X Taq Master Mix 10μL
pKSU-F 1μL
pKSU-R 1μL
Bacterium solution 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
58℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 1 min 30 sec
72℃ 10 min
16℃ ∞
Selecting positive clones by PCR

The transformants were cultured at 42℃ with chloramphenicol to select single-crossover clones.

20μL PCR system
2X Taq Master Mix 10μL
luxS-up-F 1μL
luxS-dn-R 1μL
Bacterium solution 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
56℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 2 min
72℃ 10 min
16℃ ∞
Selecting single-crossover clones using PCR
(No.1-4 are single-crossover strains, No.5 is positive control.)

Week2

The single-crossover strains were then cultured at LB medium and passaged every 12 hours for 4 generation.

Cultured the last generation at medium with 5-fluorouracil to select double-crossover clones. Regretfully, we didn't get the double-crossover clones.

20μL PCR system
2X Taq Master Mix 10μL
luxS-up-F 1μL
luxS-dn-R 1μL
Bacterium solution 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
56℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 2 min
72℃ 10 min
16℃ ∞
Selecting double-crossover clones using PCR
(No.1-5 are experimental groups, No.6 is wild GR286.The result showed that we failed to get the double-crossover clones.)

Week3

We cultured transformants at 42℃ with chloramphenicol again and selected the single-crossover clones successfully.

20μL PCR system
2X Taq Master Mix 10μL
luxS-up-F 1μL
luxS-dn-R 1μL
Bacterium solution 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
56℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 2 min
72℃ 10 min
16℃ ∞
Selecting single-crossover clones using PCR
(No.1&2&4 are single-crossover strains,No.5 is positive control. )

The single-crossover strains were then cultured at LB medium and passaged every 12 hours for 4 generations.

Cultured the last generation at medium with 5-fluorouracil to select double-crossover clones. We finally got our aimed strain—GR286ΔluxS.

20μL PCR system
2X Taq Master Mix 10μL
luxS-up-F 1μL
luxS-dn-R 1μL
Bacterium solution 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
56℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 2 min
72℃ 10 min
16℃ ∞
Selecting the strain lacking of luxS gene using PCR
(The No.4 is the aimed strainGR286ΔluxS)

Week4

Cultured the GR286ΔluxS strain and made it competence for future use.

Cloned the lsrACDB gene from Bacillus thuringiensis and ligated it to T-vector.

50μL PCR system X2
2X Taq Master Mix 25μL
lsrACDB-F 2μL
lsrACDB-R 2μL
Bacterium solution 2μL
ddH2O 19μL
Total 50μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
57℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 4 min 30 sec
72℃ 10 min
16℃ ∞
20μL ligation system
10X DNA Ligase Buffer 2μL
T4 DNA Ligase 1μL
pMD19 T-Simple Vector 1μL
lsrACDB 3μL
ddH2O 13μL
Total 20μL
Reaction condition: 16℃ overnight

Transformed the T-lsrACDB into DH5α and coated plate, and then selected positive clones by colony PCR.

20μL PCR system
2X Taq Master Mix 10μL
M13F 1μL
M13R 1μL
Bacterium solution 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
59℃ 30 sec 30 cycles
72℃ 4 min 30 sec
72℃ 10 min
16℃ ∞
Selecting positive clones by PCR
(No. 3&4 are positive results)

After restriction enzyme digestion verification, we sent them to sequencing. Unfortunately, the sequencing result showed some mutations in cloning gene.

20μL digestion system
10X FastDigest Buffer 2μL
BamH Ⅰ 1μL
T-lsrACDB 1μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
Reaction condition: 37℃ for 40 min
Restriction enzyme digestion verification
(No.1 are lsrACDB fragement, No.2 are linearized T-vector.)

We repeated the process of gene cloning but there were still some mutations.

We finally decided to request the gene company to synthesize the lsrACDB gene.

Week5

This week, we started to construct another controller―supplier.

We cloned a strong promoter C2 from former kit and cloned luxS gene from GR286.

50μL PCR system X2
2X Taq Master Mix 25μL
C2-F 2μL
C2-R 2μL
p-C2 2μL
ddH2O 19μL
Total 50μL
PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
58℃ 15 sec 30 cycles
72℃ 30 sec
72℃ 10 min
16℃ ∞
50μL PCR system X2
2X Taq Master Mix 25μL
luxS-F 2μL
luxS-R 2μL
Bacterium solution 1μL
GR286 2μL
ddH2O 19μL
Total 50μL

PCR reaction condition
94℃ 10 min
94℃ 30 sec
59℃ 30 sec 30 cycles
72℃