Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week13"

(Created page with "{{Paris_Pasteur_Microbiology}} <html> <link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,300,700' rel='stylesheet' type='text/css'> <style type="text/css"> b...")
 
Line 38: Line 38:
 
h5 {
 
h5 {
 
         display:block;
 
         display:block;
−
  font-size: 20px;
+
        font-size: 30px;
 
         color:#17A3B5;
 
         color:#17A3B5;
 
         font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 
         font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
−
  padding-top:1%;
+
        padding-top:1%;
 
         margin-left:10%;
 
         margin-left:10%;
 
}
 
}
Line 205: Line 205:
 
}
 
}
  
−
 
+
#home{
 +
font-size:0;
 +
width: 20%;
 +
margin-top:1%;
 +
  margin-left:45%;
 +
}
  
 
</style>
 
</style>
 +
 +
<body>
 +
 +
  <div>
 +
 +
  <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><h2><B>Microbiology Notebook</B></h2><a/>
 +
</div>
 +
 +
<div id="home">
 +
<center></a><a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/5/5a/Labwork_pasteur.png" width="40%" alt=""/></img></a></center>
 +
</div>
 +
 +
 +
<div id="week14">
 +
    <p><h5><B>September 6, 2016:</B></h5></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp1"> <h4>Growth of bacteria </h4></a></br>
 +
  </p>
 +
    <p><h5><B>September 7, 2016:</B></h5></p>
 +
    <p>
 +
        <a href="#exp2"><h4> Purification of the protein </h4></a></br>
 +
    </p>
 +
    <p><h5><B>September 8, 2016:</B></h5></p>
 +
    <p>
 +
          <a href="#exp3"><h4> Protein gel on SDS-Page </h4></a></br>
 +
          <a href="#exp4"><h4> Harvest the culture with Miniprep </h4></a></br>
 +
 +
    </p>
 +
<p><h5><B>September 9, 2016:</B></h5></p>
 +
    <p>
 +
          <a href="#exp5"><h4> Extraction of plasmid DNA </h4></a></br>
 +
          <a href="#exp6"><h4> Measure the amount of DNA extracted from the miniprep </h4></a></br>
 +
 +
    </p>
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp1">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.</br> </br>
 +
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                  &bull; 2 2L erlenmeyers</br>
 +
                  &bull; LB (lysogeny Luria broth)</br>
 +
                  &bull; IPTG (0.1M)</br>
 +
                  &bull; Precultures in 25ml erlenmeyers</br>
 +
                  &bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)</br>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
 +
                  &bull; Centrifuge</br>
 +
                  &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)</br> </br>
 +
 +
                  <U>Method:</U></br>
 +
                  Put 1L of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150RPM</br>
 +
                  Once warmed, add 12.5ml of preculture in each erlenmeyer</br>
 +
                  Let grow in the shaking incubator.</br>
 +
                  Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min</br> </br>
 +
 +
                <table>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Time</th>
 +
                            <th>C2(1)</th>
 +
                            <th>C2(2)</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>10:30AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0</td>
 +
                            <td>0 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>01:55PM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.438</td>
 +
                            <td>/</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>2:25PM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.602</td>
 +
                            <td>0.429 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>2:45PM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.679</td>
 +
                            <td>0.600 </td>
 +
                          </tr>       
 +
                      </tbody>
 +
                  </table>
 +
                  <center>Optical Density</center></br></br></br>
 +
 +
 +
                5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1mM. (3:00PM)</br>
 +
                6. The last measure before induction is pelleted 3min at 8000g and stored at -20°C.</br> 
7. Let induce overnight in the shaking incubator at 15°C at 150RPM</br>
 +
                8. The day after, measure the OD and store the measure pelleted at -20°C.</br>
 +
                9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.</br> </br>
 +
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
      </p>
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp2">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Purifying the protein C2 produced by BL21(DE3) using a Fast Purification Liquid Chromatography. We use the culture induced the previous day. </br> </br>
 +
 +
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                &bull; Fast Purification Liquid Chromatography </br>
 +
                &bull; Chaotropic reagent (Guanidinium 6M) </br>
 +
                &bull; EDTA 0,1M </br>
 +
                &bull; PMSF (100mM) </br>
 +
                &bull; Ni 2+ solution (100mM) </br>
 +
                &bull; Centrifuge (labo deshmukh) </br>
 +
                &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl) </br>
 +
                &bull; Buffer B (50mM Tris, 150mM of NaCl, 250mM Imidazole, pH=7.4) </br> </br>
 +
 +
                <U>Method:</U></br>
 +
                Melt the pellet of bacteria C2 (from 1L culture) and resuspend it with 10ml of buffer A. We had 25ml of pellet we complete until 40ml with buffer A. </br>
 +
                Add 40 &#181;L of PMSF to avoid protein denaturation. </br>
 +
                Put the column on the FPLC, clean the FPLC with water and then fill it with buffer A. </br>
 +
                Sonicate the sample three times one minute at 60%, wait 90 seconds between each sonication. </br>
 +
                Centrifuge 25 min at 16000g (rotor JA 25.50) </br>
 +
                Inject your sample in the FPLC </br>
 +
                Get back several samples: </br>
 +
                  &bull; C: Crude extract : before centrigugation </br>
 +
                  &bull; P: Pellet </br>
 +
                  &bull; SN: Supernatant </br>
 +
                  &bull; F: Flow through (unfixed proteins) </br>
 +
                  &bull; W: Wash 5% of buffer B </br>
 +
                  &bull; Fractions (depending on the gradient) </br> </br>
 +
              </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp3">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Get the size of the protein purified thanks to FPLC in order to know if it is our protein </br> </br>
 +
 +
              <U>Material: </U>
 +
              &bull; SDS-Page cuve </br>
 +
              &bull; SDS-Page gel (BIORAD) </br>
 +
              &bull; Protein migration buffer </br>
 +
              &bull; Protein ladder </br>
 +
              &bull; Laemmli 2X </br>
 +
              &bull; Coomassie Blue </br>
 +
              &bull; Microbiology equipment (Follow this link) </br> </br>
 +
 +
              <U>Method:</U>
 +
              In 9 1.5ml eppendorf, put 20 &#181;L of a sample and 20 &#181;L of Laemmli 2X. </br>
 +
              Let denaturate the proteins 5min at 95°C </br>
 +
              Place the gel into the cuve and fill it with migration buffer </br>
 +
              Follow the next deposit table: </br>
 +
 +
                &bull; Fraction 13 </br>
 +
                &bull; Fraction 15 </br>
 +
                &bull; Fraction 17 </br>
 +
                &bull; Fraction 19 </br>
 +
                &bull; Fraction 21 </br>
 +
                &bull; Fraction 23 </br>
 +
                &bull; Fraction 25 </br>
 +
                &bull; Fraction 27 </br>
 +
                &bull; Protein gene ruler (8 &#181;L) </br>
 +
              4. Launch the migration at 130V. </br>
 +
              5. Wash the gel three times with distilled water during 5min. </br>
 +
              6. Color the gel with Coomassie Blue diluted 1/5 during 30min. </br>
 +
              7. Wash with distilled water for 5min then let wash 15min.
 +
              </br> </br>
 +
              </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp4">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 </br>
 +
                In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.</br> </br>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                &bull; Microbiology equipement </br>
 +
                &bull; 15 mL Falcons </br>
 +
                &bull; Carbenicillin 50 mg/ml </br>
 +
                &bull; LB medium </br> </br>
 +
 +
                <U>Method:</U></br>
 +
                One colony is picked from the plates and shaken in 5.0 mL of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml. </br>
 +
                The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight. </br> </br>
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp5">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1a with the inserts A1 / A2 / B1 / B2 / C1 / C2 / D1 / D2 / E1 / E2 from cultures made on the 8/09. </br> The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep. </br>
 +
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
              &bull; 50 ml Falcon tube </br>
 +
              &bull; Shaking incubator (INFORS HT) </br>
 +
              &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41) </br>
 +
              &bull; QIAGEN Miniprep kit </br>
 +
              &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this link) </br> </br>
 +
 +
            <U>Method:</U></br>
 +
              The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below. </br> </br>
 +
 +
 +
            Follow QIAGEN kit steps. Final volume: 100 &#181;L </br> </br>
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp6">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) </br> </br>
 +
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                    &bull; Nanodrop (Thermofisher) </br>
 +
                    &bull; Elution buffer from QIAGEN kit </br>
 +
                    &bull; Microbiology equipment (Follow this link) </br> </br>
 +
 +
                <U>Method:</U></br>
 +
                Analyze absorbance at 260nm </br>
 +
                Clean the Nanodrop with water </br>
 +
                Make the blank with 1ul of elution buffer </br>
 +
                Put 1ul of your sample on the Nanodrop </br>
 +
                Make the measure and clean the Nanodrop between each measure </br> </br>
 +
 +
                <U>Results:</U></br>
 +
                <table>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Absorbance at 260nm</th>
 +
                            <th>A260</th>
 +
                            <th>A280</th>
 +
                            <th>A260/280</th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A1</p></strong></td>
 +
                            <td>0.645</td>
 +
                            <td>0.345</td>
 +
                            <td>1.87</td>
 +
                            <td>32.3</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A1’ <sub>(diluted 1/2)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>1.314</td>
 +
                            <td>0.704</td>
 +
                            <td>1.86 </td>
 +
                            <td>65.7 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A2<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>1.404</td>
 +
                            <td>0.752</td>
 +
                            <td>1.87 </td>
 +
                            <td>70.2</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A2’<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>0.494</td>
 +
                            <td>0.269</td>
 +
                            <td>1.87</td>
 +
                            <td>24.7</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>C1<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>0.305 </td>
 +
                            <td>0.165</td>
 +
                            <td>1.85 </td>
 +
                            <td>15.2 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>C1’<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>0.812 </td>
 +
                            <td>0.445</td>
 +
                            <td>1.83</td>
 +
                            <td>40.6</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>C2<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>0.499 </td>
 +
                            <td>0.272</td>
 +
                            <td>1.83</td>
 +
                            <td>24.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>C2’<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>0.757 </td>
 +
                            <td>0.402</td>
 +
                            <td>1.88</td>
 +
                            <td>37.8</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>D1<sub> (diluted 1/4)</sub></p></strong></td>
 +
                            <td>0.441 </td>
 +
                            <td>0.233</td>
 +
                            <td>1.89</td>
 +
                            <td>22.1 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>D1’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.725</td>
 +
                            <td>0.396</td>
 +
                            <td>1.83</td>
 +
                            <td>36.3</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>D2<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.264 </td>
 +
                            <td>0.141</td>
 +
                            <td>1.87</td>
 +
                            <td>13.2</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>D2’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.418 </td>
 +
                            <td>0.216</td>
 +
                            <td>1.94</td>
 +
                            <td>20.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>E1<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.487 </td>
 +
                            <td>0.266</td>
 +
                            <td>1.83</td>
 +
                            <td>24.3</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>E1’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.478 </td>
 +
                            <td>0.247</td>
 +
                            <td>1.94</td>
 +
                            <td>24.0</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>E2<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>1.364</td>
 +
                            <td>0.742</td>
 +
                            <td>1.84</td>
 +
                            <td>68.2</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>E2’<sub> (diluted 1/4)</sub>)</p></strong></td>
 +
                            <td>1.041 </td>
 +
                            <td>0.562</td>
 +
                            <td>1.85</td>
 +
                            <td>52.1</td>
 +
                          </tr>
 +
                            </tbody>
 +
                  </table>
 +
                  <center>Absorbance</center></br></br></br>
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>

Revision as of 08:24, 16 October 2016