Difference between revisions of "Team:Pasteur Paris/Microbiology week13"

(Replaced content with "{{Paris_Pasteur_Microbiology}}")
Line 1: Line 1:
 
{{Paris_Pasteur_Microbiology}}
 
{{Paris_Pasteur_Microbiology}}
 +
 +
<html>
 +
 +
<link href='https://fonts.googleapis.com/css?family=Open+Sans:400,300,700' rel='stylesheet' type='text/css'>
 +
<style type="text/css">
 +
 +
body{
 +
position: relative;
 +
 +
}
 +
 +
h2 {
 +
        display:block;
 +
  font-size: 42px;
 +
        font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 +
  color:#333;
 +
  padding-top:-10px;
 +
        margin-left:10%;
 +
}
 +
 +
h3 {
 +
        display:block;
 +
  font-size: 27px;
 +
        font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 +
  color:#333;
 +
  padding-top:1%;
 +
        margin-left:10%;
 +
}
 +
 +
h4 {
 +
        display:block;
 +
  font-size: 20px;
 +
        font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 +
  padding-top:1%;
 +
        margin-left:10%;
 +
}
 +
h5 {
 +
        display:block;
 +
        font-size: 30px;
 +
        color:#17A3B5;
 +
        font-family: 'Oswald', Arial, sans-serif;
 +
        padding-top:1%;
 +
        margin-left:10%;
 +
}
 +
 +
#lightbox{
 +
    z-index:1001;
 +
}
 +
div.lightbox {
 +
  display: none;
 +
  position: fixed;
 +
  left: 0;
 +
  top: 0;
 +
  width: 100%;
 +
  height: 100%;
 +
    z-index:1001;
 +
 +
}
 +
 +
/*afficher le contenu des titres*/
 +
div.lightbox:target {
 +
    display: table;
 +
    z-index:4001;
 +
}
 +
 +
/*alignement du contenu pour tout navigateur*/
 +
div.lightbox figure {
 +
  display: table-cell;
 +
  margin: 0;
 +
  padding: 0;
 +
  width: 100%;
 +
  height: 100%;
 +
  vertical-align: middle;
 +
      z-index:1001;
 +
}
 +
 +
/*arrière plan du contenu bleu claire font plus foncé*/
 +
div.lightbox figure figcaption {
 +
  display: block;
 +
  z-index:4000;
 +
  margin: auto;
 +
  padding: 8px;
 +
  background-color: #e4f2f3 ;
 +
  height: 500px;
 +
  position: relative;
 +
  overflow: auto;
 +
  border: 1px #000000 solid;
 +
  border-radius: 10px;
 +
  text-align: justify;
 +
  font-size: 14px;
 +
}
 +
 +
 +
div.lightbox figure .closemsg {
 +
  display: block;
 +
  margin: auto;
 +
  height: 0;
 +
  overflow: visible;
 +
  text-align: right;
 +
 +
  cursor: default;
 +
}
 +
 +
div.lightbox figure .closemsg, div.lightbox figure figcaption {
 +
  width: 70%;
 +
 +
}
 +
 +
/*croix pour fermer*/
 +
.closemsg::after {
 +
  content: "\00D7";
 +
  display: inline-block;
 +
  position: relative;
 +
  right: -20px;
 +
  top: -10px;
 +
  color: ##e4f2f3;
 +
  border: 1px #ffffff solid;
 +
  border-radius: 10px;
 +
  width: 20px;
 +
  height: 20px;
 +
  line-height: 18px;
 +
  text-align: center;
 +
  margin: 0;
 +
  background-color: #e4f2f3;
 +
  font-weight: bold;
 +
  cursor: pointer;
 +
}
 +
 +
strong {
 +
  font-weight: bold;
 +
}
 +
 +
 +
 +
table {
 +
  background: #f5f5f5;
 +
  border-collapse: separate;
 +
  box-shadow: inset 0 1px 0 #fff;
 +
  font-size: 12px;
 +
  line-height: 24px;
 +
  margin: 30px auto;
 +
  text-align: left;
 +
  width: 400px;
 +
}
 +
 +
th {
 +
  background: linear-gradient(#777, #444);
 +
  border-left: 1px solid #555;
 +
  border-right: 1px solid #777;
 +
  border-top: 1px solid #555;
 +
  border-bottom: 1px solid #333;
 +
  box-shadow: inset 0 1px 0 #999;
 +
  color: #fff;
 +
  font-weight: bold;
 +
  padding: 10px 15px;
 +
  position: relative;
 +
  text-shadow: 0 1px 0 #000; 
 +
}
 +
 +
th:after {
 +
  background: linear-gradient(rgba(255,255,255,0), rgba(255,255,255,.08));
 +
  content: '';
 +
  display: block;
 +
  height: 25%;
 +
  left: 0;
 +
  margin: 1px 0 0 0;
 +
  position: absolute;
 +
  top: 25%;
 +
  width: 100%;
 +
}
 +
 +
th:first-child {
 +
  border-left: 1px solid #777; 
 +
  box-shadow: inset 1px 1px 0 #999;
 +
}
 +
 +
th:last-child {
 +
  box-shadow: inset -1px 1px 0 #999;
 +
}
 +
 +
td {
 +
  border-right: 1px solid #fff;
 +
  border-left: 1px solid #e8e8e8;
 +
  border-top: 1px solid #fff;
 +
  border-bottom: 1px solid #e8e8e8;
 +
  padding: 10px 15px;
 +
  position: relative;
 +
  transition: all 300ms;
 +
}
 +
 +
td:first-child {
 +
  box-shadow: inset 1px 0 0 #fff;
 +
}
 +
 +
td:last-child {
 +
  border-right: 1px solid #e8e8e8;
 +
  box-shadow: inset -1px 0 0 #fff;
 +
}
 +
 +
 +
 +
tr:nth-child(odd) td {
 +
  background: #f1f1f1 ;
 +
}
 +
 +
#home{
 +
font-size:0;
 +
width: 20%;
 +
margin-top:1%;
 +
  margin-left:45%;
 +
}
 +
 +
</style>
 +
 +
<body>
 +
 +
  <div>
 +
 +
  <a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><h2><B>Microbiology Notebook</B></h2><a/>
 +
</div>
 +
 +
<div id="home">
 +
<center></a><a href="https://2016.igem.org/Team:Pasteur_Paris/Microbiology"><img src="https://static.igem.org/mediawiki/2016/5/5a/Labwork_pasteur.png" width="40%" alt=""/></img></a></center>
 +
</div>
 +
 +
 +
<div id= "week13">
 +
        <p><h5><B>Week 13</B></h5></p>
 +
        <p><h3><B>August 29, 2016:</B></h3></p>
 +
            <p>
 +
            <a href="#exp1"><h4>Measure the amount of DNA extracted from the miniprep</h4></a></br>
 +
            </p>
 +
            <p><h3><B>September 1, 2016:</B></h3></p>
 +
            <p>
 +
        <a href="#exp2"><h4>Harvest the culture with Midiprep</h4></a></br>
 +
    </p>
 +
    <p><h3><B>September 2, 2016:</B></h3></p>
 +
    <p>
 +
          <a href="#exp3"><h4> Growth of bacteria </h4></a></br>
 +
          <a href="#exp4"><h4> Extraction of plasmid DNA </h4></a></br>
 +
 +
    </p>
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp1">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> Measure the quantity of plasmid using a Nanodrop (Thermofisher) before sending for sequencing (inserts B1 and C2)</br></br>
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                  &bull; Nanodrop (Thermofisher)</br>
 +
                  &bull; Elution buffer from QIAGEN kit</br>
 +
                  &bull; Microbiology equipment (Follow this link)</br></br>
 +
 +
                  <U>Method:</U></br>
 +
                  Analyze absorbance at 260nm</br>
 +
                  Clean the Nanodrop with water</br>
 +
                  Make the blank with 1ul of elution buffer</br>
 +
                  Put 1ul of your sample on the Nanodrop</br>
 +
                  Make the measure and clean the Nanodrop between each measure</br></br>
 +
 +
                <U>Results:</U></br>
 +
                <table>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Absorbance at 260nm</th>
 +
                            <th>A260</th>
 +
                            <th>A280</th>
 +
                            <th>A260/280</th>
 +
                            <th>Concentration (ng/&#181;L )</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A1(1)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.202 </td>
 +
                            <td>0.124</td>
 +
                            <td>1.62 </td>
 +
                            <td>10.1</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A1(2)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.259 </td>
 +
                            <td>0.169</td>
 +
                            <td>1.53 </td>
 +
                            <td>13.0 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A2(1)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.179</td>
 +
                            <td>0.105</td>
 +
                            <td>1.70 </td>
 +
                            <td>8.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A2(2)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.179 </td>
 +
                            <td>0.103</td>
 +
                            <td>1.73</td>
 +
                            <td>8.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A2(3)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.098 </td>
 +
                            <td>0.052</td>
 +
                            <td>1.86 </td>
 +
                            <td>4.9 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>A2(4)</p></strong></td>
 +
                            <td>0.152 </td>
 +
                            <td>0.099</td>
 +
                            <td>1.53</td>
 +
                            <td>7.6 </td>
 +
                          </tr>
 +
                                              </tbody>
 +
                  </table>
 +
                  <center>Absorbance</center></br></br></br>
 +
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
 +
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp2">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
              <figcaption>
 +
                  <p><U> Aim:</U> To start a culture for Miniprep of insert C2 in pET43.1a in BL21(DE3) from 22/08 and A1/C2 in pET43.1a in TOP1O. </br>
 +
                  In order to obtain a large amount of plasmid, we need to grow the bacteria overnight.
 +
                </br></br>
 +
 +
                  <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
                  <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
                  <U>Materials:</U></br>
 +
                    &bull; Microbiology equipement </br>
 +
                    &bull; 50mL erlenmeyers</br>
 +
                    &bull; Carbenicillin 50 mg/ml</br>
 +
                    &bull; LB medium</br></br>
 +
 +
                  <U>Method:</U></br>
 +
                  One colony is picked from the plates and shaken in 25.0 mL of LB supplemented with Carbenicillin at 50 &#181;g/ml.</br>
 +
                  The flask is placed in a shaking incubator at 37°C, 150 rpm overnight.
 +
                  </br></br>
 +
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp3">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
              <figcaption>
 +
                  <p><U> Aim:</U> Produce our protein in BL21(DE3) competent cells, the production is induced with IPTG once it reaches an optical density of 0.7.</br></br>
 +
 +
                  <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
                  <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
                  <U>Materials:</U></br>
 +
                  &bull; 2 2L erlenmeyers</br>
 +
                  &bull; LB (lysogeny Luria broth)</br>
 +
                  &bull; IPTG (0.1M)</br>
 +
                  &bull; Precultures in 25ml erlenmeyers</br>
 +
                  &bull; UV spectrophotometer (Ultrospec 3100)</br>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
 +
                  &bull; Centrifuge</br>
 +
                  &bull; Buffer A (50mM Tris, 150mM of NaCl)</br></br>
 +
 +
                  <U>Method:</U></br>
 +
                  Put 1L of LB in each erlenmeyer and make them warm with the shaking incubator at 37°C and 150RPM</br>
 +
                  Once warmed, add 12.5ml of preculture in each erlenmeyer</br>
 +
                  Let grow in the shaking incubator.</br>
 +
                  Measure the absorbance with the UV spectrophotometer every 30min</br></br>
 +
 +
                  <table>
 +
                    <thead>
 +
                        <tr>
 +
                            <th>Time</th>
 +
                            <th>C2(1)</th>
 +
                            <th>C2(2)</th>
 +
                        </tr>
 +
                  </thead>
 +
                    <tbody>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>9:36AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.024 </td>
 +
                            <td>0.023 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>10:06AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.049</td>
 +
                            <td>0.046 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>11:02AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.175</td>
 +
                            <td>0.165</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>11:36AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.395 </td>
 +
                            <td>0.402 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>12:05AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.568</td>
 +
                            <td>0.540 </td>
 +
                          </tr>       
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>12:27AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.658 </td>
 +
                            <td>0.638</td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>12:38AM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.694 </td>
 +
                            <td>0.680 </td>
 +
                          </tr>
 +
                          <tr>
 +
                            <td><strong><p>14:31PM</p></strong></td>
 +
                            <td>0.872 </td>
 +
                            <td>0.859 </td>
 +
                          </tr>
 +
                      </tbody>
 +
                  </table>
 +
                  <center>Optical Density</center></br></br></br>
 +
 +
 +
                    5. Add IPTG to reach a concentration of 0.1mM. (12:57AM)</br>
 +
                    6. The last measure before induction is pelleted 3min at 8000g and stored at -20°C.</br>
7. Let induce overnight in the shaking incubator</br>
 +
                    8. After 7 hours of induction, measure the OD and store the measure pelleted at -20°C.</br>
 +
                    9. Centrifuge at 4500RPM the culture and throw out the supernatant, the pellet resuspended in 5ml of buffer A are stored at -80°C before protein extraction.
 +
                    </br></br>
 +
            </p>
 +
          </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
    <div class="lightbox" id="exp4">
 +
      <figure>
 +
          <a href="#" class="closemsg"></a>
 +
            <figcaption> 
 +
              <p>
 +
              <U> Aim:</U> To perform a Midiprep to isolate plasmid DNA of pET43.1a with the inserts A1/C2 from cultures made on the 1/09. </br>The amplification method to increase the amount of plasmid is called Midiprep.</br></br>
 +
 +
              <U> Protocol:</U> follow in this link</br></br>
 +
              <U>What we did in the lab:</U></br>
 +
              <U>Materials:</U></br>
 +
                  &bull; 50 ml Falcon tube</br>
 +
                  &bull; Shaking incubator (INFORS HT)</br>
 +
                  &bull; Swing bucket centrifuge (JOUAN GR41)</br>
 +
                  &bull; QIAGEN Miniprep kit</br>
 +
                  &bull; Microbiology equipment (type of incubator, Bunsen burner, water bath, etc… Follow this link)</br></br>
 +
 +
                <U>Method:</U></br>
 +
                  The protocol in step 1 ask for spinning at 6000g but we can only achieve 3500 g so we used 3500 g for 8 minutes. We will follow most of the protocol of QIAGEN Miniprep 2016 except for a few modifications, which we describe, therefore, below.</br></br>
 +
 +
 +
                Follow QIAGEN kit steps. Final volume: 100 &#181;L</br></br>
 +
 +
              </p>
 +
            </figcaption>
 +
      </figure>
 +
    </div>
 +
 +
    </div>
 +
</div>
 +
</body>
 +
</html>

Revision as of 08:44, 16 October 2016