Difference between revisions of "Team:Valencia UPV/Notebook/Protocol"

Line 1: Line 1:
 
{{:Team:Valencia_UPV/Templates:headerGeneralUPV}}
 
{{:Team:Valencia_UPV/Templates:headerGeneralUPV}}
 
  
 
<html>
 
<html>
 
<body>
 
<body>
 
 
     <section class="page-header dark" style="margin-top: -2px">
 
     <section class="page-header dark" style="margin-top: -2px">
 
         <div class="container">
 
         <div class="container">
Line 28: Line 26:
 
                             </li>
 
                             </li>
 
                             <li class="list-group-item">
 
                             <li class="list-group-item">
                                 <a href=                           "https://2016.igem.org/Team:Valencia_UPV/Notebook/Protocol#OrangeDNAGenomeExtractionProtocol(AdaptedfromDelaportaextractionprotocol)_id">
+
                                 <a href=
 +
                                "https://2016.igem.org/Team:Valencia_UPV/Notebook/Protocol#OrangeDNAGenomeExtractionProtocol(AdaptedfromDelaportaextractionprotocol)_id">
 
                                 <span class=
 
                                 <span class=
 
                                 "size-11 text-muted pull-right"></span>Orange
 
                                 "size-11 text-muted pull-right"></span>Orange
Line 487: Line 486:
 
                                 </div>
 
                                 </div>
 
                                 <p></p>
 
                                 <p></p>
                             <li>3.Measuring OD</li>
+
                             <li>Measuring OD
                            <li>C<sub>0</sub>1 x V<sub>0</sub>1 = C x V V = 20 mL
+
                            <ul>
                            C=0.2 g/mol</li>
+
                                <li>C<sub>0</sub> x V<sub>0</sub> = C x V &emsp; V = 20 mL &emsp; C = 0.2 g/mol</li>
                            <li><sub>V<sub>0</sub> = (0.2 x 20)/(0.38 x 5)=2.11 mL of
+
                                <li>V<sub>0</sub> = (0.2 x 20)/(0.38 x 5)=2.11 mL of
 
                             culture is necessary to obtain the required optical
 
                             culture is necessary to obtain the required optical
                             density.</sub></li>
+
                             density.
 +
                                </li>
 +
                            </ul>
 +
                            </li>
 
                         </ol>
 
                         </ol>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div class="blog-post-item" id="E.coliTransformation_id">
 
                     <div class="blog-post-item" id="E.coliTransformation_id">
                        <sub></sub>
+
                         <h3>E.coli Transformation</h3>
                         <h3><sub>E.coli Transformation</sub></h3>
+
                         <p></p>
                         <p><sub></sub></p>
+
                         Electroporation method was used in order to
                         <ul>
+
                             transform a DNA construction. This procedure is
                            <li><sub>Electroporation method was used in order
+
                             commonly used for E. coli and <i>Agrobacterium</i>.
                             to transform a DNA construction. This procedure is
+
                        <ol>
                             commonly used for E. coli and
+
                                     <li>The electroporation cuvette was put in
                            <i>Agrobacterium</i>.</sub></li>
+
                                     ice 10 minutes before inserting the cells.
                            <li style="list-style: none">
+
                                     An aliquot of electrocompetent cells are
                                <sub><br>
+
                                     taken out of the -80°C freezer, and they
                                <br></sub>
+
                                     are put immediately into ice.</li>
                                <ul>
+
                                     <li>1-2 ul of the ligation product are
                                     <li><sub>he electroporation cuvette was put
+
                                     taken and added carefully to them.</li>
                                     in ice 10 minutes before inserting the
+
                                     <li>60 ul of the mix are taken and put into
                                     cells. An aliquot of electrocompetent cells
+
                                     an electroporation cuvette making sure that
                                     are taken out of the -80°C freezer, and
+
                                     there are no bubbles.</li>
                                     they are put immediately into
+
                                     <li>The cuvette is dried and put in the
                                    ice.</sub></li>
+
                                     electroporator, making sure that any spark
                                     <li><sub>1-2 ul of the ligation product are
+
                                     is done. In that case, the process does not
                                     taken and added carefully to
+
                                    work and must be repeated. This could
                                    them.</sub></li>
+
                                     happen when plasmid and <i>E. coli</i>
                                     <li><sub>60 ul of the mix are taken and put
+
                                    concentration are not optimal.</li>
                                     into an electroporation cuvette making sure
+
                                     <li>The voltage for the electroporator is
                                     that there are no bubbles.</sub></li>
+
                                     1500V for E. coli and 1440V for
                                     <li><sub>The cuvette is dried and put in
+
                                     <i>Agrobacterium</i>.</li>
                                     the electroporator, making sure that any
+
                                     <li>Transformed cells are resuspended in
                                     spark is done. In that case, the process
+
                                     300 μL of LB in the electroporation
                                    does not work and must be repeated. This
+
                                     could happen when plasmid and <i>E.
+
                                    coli</i> concentration are not
+
                                    optimal.</sub></li>
+
                                     <li style="list-style: none">
+
                                    <sub></sub></li>
+
                                    <li><sub>The voltage for the electroporator
+
                                     is 1500V for E. coli and 1440V for
+
                                     <i>Agrobacterium</i>.</sub></li>
+
                                     <li><sub>Transformed cells are resuspended
+
                                     in 300 μL of LB in the electroporation
+
 
                                     cuvette. Then, they are taken and put into
 
                                     cuvette. Then, they are taken and put into
 
                                     an Eppendorf letting them grow in the
 
                                     an Eppendorf letting them grow in the
                                     shaker for 2 hours at 37°C.</sub></li>
+
                                     shaker for 2 hours at 37°C.</li>
                                </ul>
+
                         </ol>
                            </li>
+
                            <li><sub></sub></li>
+
                         </ul>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
                    <div class="blog-post-item" id="Minipreps_id">
+
                  <div class="blog-post-item" id="Minipreps_id">
                        <sub></sub>
+
                         <h3>Minipreps</h3>
                         <h3><sub>Minipreps</sub></h3>
+
                         <p>In order to carry out all of necessary Miniprep
                         <p><sub></sub></p>
+
                        -extraction of the plasmids out of E. coli -the
                        <ul>
+
                        protocol of the Omega kit (Plasmid DNA Mini Kit I Spin
                            <li><sub>In order to carry out all of necessary
+
                        Protocol) is used. The steps to do it are:<br></p>
                            Miniprep -extraction of the plasmids out of E. coli
+
                        <ol>
                            -the protocol of the Omega kit (Plasmid DNA Mini
+
                            <li>Grow 1-5 mL culture overnight in a 10-20 mL
                            Kit I Spin Protocol) is used. The steps to do it
+
                            culture tube.</li>
                            are:</sub></li>
+
                            <li>Centrifuge at 10.000 x g for 1minute at room
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
                            temperature. Decant or aspirate and discard the
                                <ul>
+
                            culture media.</li>
                                    <li><sub>row 1-5 mL culture overnight in a
+
                            <li>Add 250 ul Solution I mixed with RNase A.
                                    10-20 mL culture tube.</sub></li>
+
                            Vortex or pipet up and down to mix thoroughly.
                                    <li><sub>Centrifuge at 10.000 x g for
+
                            Transfer suspension into a new 1.5mL
                                    1minute at room temperature. Decant or
+
                            microcentrifuge tube.</li>
                                    aspirate and discard the culture
+
                            <li>Add 250 ul Solutions II. Invert and gently
                                    media.</sub></li>
+
                            rotate the tube several times to obtain a clear
                                    <li><sub>Add 250 ul Solution I mixed with
+
                            lysate. A 2-3 minute incubation may be necessary.
                                    RNase A. Vortex or pipet up and down to mix
+
                            Avoid vigorous mixing and do not exceed a 5 minute
                                    thoroughly. Transfer suspension into a new
+
                            incubation.</li>
                                    1.5mL microcentrifuge tube.</sub></li>
+
                            <li>Add 350 ul Solution III. Immediately invert
                                    <li><sub>Add 250 ul Solutions II. Invert
+
                            several times until a flocculent white precipitate
                                    and gently rotate the tube several times to
+
                            forms. Centrifuge at maximum speed (&gt;13.000xg)
                                    obtain a clear lysate. A 2-3 minute
+
                            for 10 minutes. A compact white pellet will form.
                                    incubation may be necessary. Avoid vigorous
+
                            Promptly proceed to the next step.</li>
                                    mixing and do not exceed a 5 minute
+
                            <li>Insert a HiBind DNA Mini Column into a 2 mL
                                    incubation.</sub></li>
+
                            Collection tube.</li>
                                    <li><sub>Add 350 ul Solution III.
+
                            <li>Transfer the cleared supernatant from Step 6
                                    Immediately invert several times until a
+
                            CAREFULLY aspirating it into the HiBind DNA Mini
                                    flocculent white precipitate forms.
+
                            Column. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.
                                    Centrifuge at maximum speed (&gt;13.000xg)
+
                            Discard the filtrate and reuse the collection
                                    for 10 minutes. A compact white pellet will
+
                            tube.</li>
                                    form. Promptly proceed to the next
+
                            <li>Add 500 ul HBC Buffer diluted with
                                    step.</sub></li>
+
                            isopropanol</li>
                                    <li><sub>Insert a HiBind DNA Mini Column
+
                            <li>Centrifuge at maximum speed for 1 minute.
                                    into a 2 mL Collection tube.</sub></li>
+
                            Discard the filtrate and reuse collection
                                    <li><sub>Transfer the cleared supernatant
+
                            tube.</li>
                                    from Step 6 CAREFULLY aspirating it into
+
                            <li>Add 700 ul DNA Wash Buffer diluted with
                                    the HiBind DNA Mini Column. Centrifuge at
+
                            ethanol. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.
                                    maximum speed for 1 minute. Discard the
+
                            Discard the filtrate and reuse the collection
                                    filtrate and reuse the collection
+
                            tube.</li>
                                    tube.</sub></li>
+
                            <li>Centrifuge the empty HiBind DNA Mini Column at
                                    <li><sub>Add 500 ul HBC Buffer diluted with
+
                            maximum speed for 2 minutes to dry the column. This
                                    isopropanol</sub></li>
+
                            step is critical for removal of trace ethanol that
                                    <li><sub>Centrifuge at maximum speed for 1
+
                            may interfere with downstream applications.</li>
                                    minute. Discard the filtrate and reuse
+
                            <li>Transfer the HiBind DNA Mini Column into a
                                    collection tube.</sub></li>
+
                            nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tube.</li>
                                    <li><sub>Add 700 ul DNA Wash Buffer diluted
+
                            <li>Add 50 ul Elution Buffer or sterile deionized
                                    with ethanol. Centrifuge at maximum speed
+
                            water directly to the center of the column
                                    for 1 minute. Discard the filtrate and
+
                            membrane.Let sit at room temperature for 1 minute.
                                    reuse the collection tube.</sub></li>
+
                            Centrifuge at maximum speed for 1 minute.</li>
                                    <li><sub>Centrifuge the empty HiBind DNA
+
                            <li>Store eluted DNA at -20°C.</li>
                                    Mini Column at maximum speed for 2 minutes
+
                        </ol>
                                    to dry the column. This step is critical
+
                        <p><br></p>
                                    for removal of trace ethanol that may
+
                                    interfere with downstream
+
                                    applications.</sub></li>
+
                                    <li><sub>Transfer the HiBind DNA Mini
+
                                    Column into a nuclease-free 1.5 mL
+
                                    microcentrifuge tube.</sub></li>
+
                                    <li><sub>Add 50 ul Elution Buffer or
+
                                    sterile deionized water directly to the
+
                                    center of the column membrane.Let sit at
+
                                    room temperature for 1 minute. Centrifuge
+
                                    at maximum speed for 1 minute.</sub></li>
+
                                    <li><sub>Store eluted DNA at
+
                                    -20°C.</sub></li>
+
                                </ul>
+
                            </li>
+
                            <li><sub></sub></li>
+
                        </ul>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div class="blog-post-item" id="Petridishculture_id">
 
                     <div class="blog-post-item" id="Petridishculture_id">
                        <sub></sub>
+
                         <h3>Petri dish culture</h3>
                         <h3><sub>Petri dish culture</sub></h3>
+
                         <p>Bacteria are transformed with a plasmid which gives
                         <p><sub></sub></p>
+
                        them resistance to a specific antibiotic. Petri dishes
 +
                        must include this antibiotic to reject those bacteria
 +
                        that have not acquired the plasmid.<br></p>
 
                         <ul>
 
                         <ul>
                             <li><sub>Bacteria are transformed with a plasmid
+
                             <li>E. coli- pUPD2 plasmids: chloramphenicol.</li>
                            which gives them resistance to a specific
+
                            <li>E. coli- Alpha 1 and 2: kanamycin.</li>
                            antibiotic. Petri dishes must include this
+
                            <li>E. coli- Omega 1 and 2: streptomycin</li>
                            antibiotic to reject those bacteria that have not
+
                            <li><i>Agrobacterium</i>: rifampicin + the specific
                            acquired the plasmid.</sub></li>
+
                            one for each construction.</li>
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
                                <ul>
+
                                    <li><sub>. coli- pUPD2 plasmids:
+
                                    chloramphenicol.</sub></li>
+
                                    <li><sub>E. coli- Alpha 1 and 2:
+
                                    kanamycin.</sub></li>
+
                                    <li><sub>E. coli- Omega 1 and 2:
+
                                    streptomycin</sub></li>
+
                                    <li><sub><i>Agrobacterium</i>: rifampicin +
+
                                    the specific one for each
+
                                    construction.</sub></li>
+
                                </ul>
+
                            </li>
+
                            <li><sub>To carry out this procedure is necessary
+
                            to work in the laminar flux cabinet.</sub></li>
+
                            <li style="list-style: none"><sub></sub></li>
+
                            <li><sub>This procedure is necessary to made it in
+
                            the laminar flux cabinet. After <i>E. coli</i>
+
                            transformation, cells are put into an Eppendorf
+
                            letting them grow at 37°C. The spread plate method
+
                            is done with 50-40 ul of this bacteria culture. To
+
                            plate it is used aIt is used for plating a glass
+
                            dipstick. After that, <i>E. coli</i> culture plates
+
                            are put at 37°C for approximately 16h.
+
                            <i>Agrobacterium</i> growth needs 32h at
+
                            28°C.</sub></li>
+
                            <li><sub></sub></li>
+
 
                         </ul>
 
                         </ul>
 +
                        <p>To carry out this procedure is necessary to work in
 +
                        the laminar flux cabinet.<br>
 +
                        This procedure is necessary to made it in the laminar
 +
                        flux cabinet. After <i>E. coli</i> transformation,
 +
                        cells are put into an Eppendorf letting them grow at
 +
                        37°C. The spread plate method is done with 50-40 ul of
 +
                        this bacteria culture. To plate it is used aIt is used
 +
                        for plating a glass dipstick. After that, <i>E.
 +
                        coli</i> culture plates are put at 37°C for
 +
                        approximately 16h. <i>Agrobacterium</i> growth needs
 +
                        32h at 28°C.<br>
 +
                        <br></p>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div class="blog-post-item" id="Ligationreaction_id">
 
                     <div class="blog-post-item" id="Ligationreaction_id">
                        <sub></sub>
+
                         <h3>Ligation reaction</h3>
                         <h3><sub>Ligation reaction</sub></h3>
+
                         <p>The assembly of DNA fragments, commonly referred to
                         <p><sub></sub></p>
+
                        as Golden Gate assembly, is an efficient technique
                        <ul>
+
                        where multiple inserts could be assembled into a vector
                            <li><sub>The assembly of DNA fragments, commonly
+
                        backbone. The net result is the ordered and seamless
                            referred to as Golden Gate assembly, is an
+
                        assembly of DNA fragments in only one reaction. The
                            efficient technique where multiple inserts could be
+
                        ligations have a total volume of 10 μL so all of
                            assembled into a vector backbone. The net result is
+
                        sequences that form part of the constructions are mixed
                            the ordered and seamless assembly of DNA fragments
+
                        up in an Eppendorf of 0.2mL.<br>
                            in only one reaction. The ligations have a total
+
                        This mix is put in a thermocycler with the programs GB
                            volume of 10 μL so all of sequences that form part
+
                        (Golden Braid) or GG (Golden Gate).<br>
                            of the constructions are mixed up in an Eppendorf
+
                        <br></p>
                            of 0.2mL.</sub></li>
+
                        <div class="table-responsive" style=
                            <li><sub>This mix is put in a thermocycler with the
+
                        "width:55%;overflow:inherit">
                            programs GB (Golden Braid) or GG (Golden
+
                            <table class="table table-bordered table-striped">
                            Gate).</sub></li>
+
                                <tr>
                            <li><sub></sub></li>
+
                                    <th>Reagent</th>
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
                                    <th>Volume (μL)</th>
                                <div class="table-responsive" style=
+
                                </tr>
                                "width:55%;overflow:inherit">
+
                                <tr>
                                    <sub></sub>
+
                                    <td>DNA fragments</td>
                                    <table class=
+
                                    <td>1 of each part of the assembly</td>
                                    "table table-bordered table-striped">
+
                                </tr>
                                        <tr>
+
                                <tr>
                                            <th>
+
                                    <td>Plasmid (pUPD2 - α1 - α2)</td>
                                                <ul>
+
                                    <td>1</td>
                                                    <li>Reagent</li>
+
                                </tr>
                                                </ul>
+
                                <tr>
                                            </th>
+
                                    <td>BSA 10X</td>
                                            <th>Volume (μL)</th>
+
                                    <td>1.2</td>
                                        </tr>
+
                                </tr>
                                        <tr>
+
                                <tr>
                                            <td>
+
                                    <td>Ligase Buffer</td>
                                                <ul>
+
                                    <td>1.2</td>
                                                    <li>DNA fragments</li>
+
                                </tr>
                                                </ul>
+
                                <tr>
                                            </td>
+
                                    <td>Bsmb I</td>
                                            <td>1 of each part of the
+
                                    <td>1</td>
                                            assembly</td>
+
                                </tr>
                                        </tr>
+
                                <tr>
                                        <tr>
+
                                    <td>T4 ligase</td>
                                            <td>
+
                                    <td>1</td>
                                                <ul>
+
                                </tr>
                                                    <li>Plasmid (pUPD2 - α1 -
+
                                <tr>
                                                    α2)</li>
+
                                    <td>H<sub>2</sub>O milli-Q</td>
                                                </ul>
+
                                    <td>Raise until final volume (10 μL)</td>
                                            </td>
+
                                </tr>
                                            <td>1</td>
+
                            </table>
                                        </tr>
+
                        </div>
                                        <tr>
+
                        <p></p>
                                            <td>
+
                        <div class="table-responsive" style=
                                                <ul>
+
                        "width:55%;overflow:inherit">
                                                    <li>BSA 10X</li>
+
                            <table class="table table-bordered table-striped">
                                                </ul>
+
                                <tr>
                                            </td>
+
                                    <th>DNA1 in pUPD2 + DNA2 in pUPD2 = DNA1 +
                                            <td>1.2</td>
+
                                    DNA2 in α</th>
                                        </tr>
+
                                    <th>DNA1 in α1 + DNA2 in α2 = DNA1 + DNA2
                                        <tr>
+
                                    in Ω</th>
                                            <td>
+
                                </tr>
                                                <ul>
+
                                <tr>
                                                    <li>Ligase Buffer</li>
+
                                    <td>1 μL DNA1 in pUPD2</td>
                                                </ul>
+
                                    <td>1 μL DNA1 in α1</td>
                                            </td>
+
                                </tr>
                                            <td>1.2</td>
+
                                <tr>
                                        </tr>
+
                                    <td>1 μL DNA2 in pUPD2</td>
                                        <tr>
+
                                    <td>1 μL DNA2 in α2</td>
                                            <td>
+
                                </tr>
                                                <ul>
+
                                <tr>
                                                    <li>Bsmb I</li>
+
                                    <td>1 μL of α plasmid</td>
                                                </ul>
+
                                    <td>1 μL of Ω plasmid</td>
                                            </td>
+
                                </tr>
                                            <td>1</td>
+
                                <tr>
                                        </tr>
+
                                    <td>1.2 μL buffer ligase</td>
                                        <tr>
+
                                    <td>1.2 μL buffer ligase</td>
                                            <td>
+
                                </tr>
                                                <ul>
+
                                <tr>
                                                    <li>T4 ligase</li>
+
                                    <td>1.2 μL BSA10X</td>
                                                </ul>
+
                                    <td>1.2 μL BSA10X</td>
                                            </td>
+
                                </tr>
                                            <td>1</td>
+
                                <tr>
                                        </tr>
+
                                    <td>1 μL T4 ligase</td>
                                        <tr>
+
                                    <td>1 μL T4 ligase</td>
                                            <td>
+
                                </tr>
                                                <ul>
+
                                <tr>
                                                    <li>H<sub>2</sub>O
+
                                    <td>1 μL Bsmb I</td>
                                                    milli-Q</li>
+
                                    <td>1 μL Bsa I</td>
                                                </ul>
+
                                </tr>
                                            </td>
+
                                <tr>
                                            <td>Raise until final volume (10
+
                                    <td>4.6 μL H<sub>2</sub>O milli-Q</td>
                                            μL)</td>
+
                                    <td>4.6 μL H<sub>2</sub>O milli-Q</td>
                                        </tr>
+
                                </tr>
                                    </table>
+
                            </table>
                                </div>
+
                        </div>
                                <p></p>
+
                        <p></p>
                                <div class="table-responsive" style=
+
                                "width:55%;overflow:inherit">
+
                                    <table class=
+
                                    "table table-bordered table-striped">
+
                                        <tr>
+
                                            <th>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>DNA1 in pUPD2 + DNA2 in
+
                                                    pUPD2 = DNA1 + DNA2 in
+
                                                    α</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </th>
+
                                            <th>DNA1 in α1 + DNA2 in α2 = DNA1
+
                                            + DNA2 in Ω</th>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1 μL DNA1 in pUPD2</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1 μL DNA1 in α1</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1 μL DNA2 in pUPD2</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1 μL DNA2 in α2</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1 μL of α plasmid</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1 μL of Ω plasmid</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1.2 μL buffer
+
                                                    ligase</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1.2 μL buffer ligase</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1.2 μL BSA10X</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1.2 μL BSA10X</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1 μL T4 ligase</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1 μL T4 ligase</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>1 μL Bsmb I</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1 μL Bsa I</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>4.6 μL H<sub>2</sub>O
+
                                                    milli-Q</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>4.6 μL H<sub>2</sub>O
+
                                            milli-Q</td>
+
                                        </tr>
+
                                    </table>
+
                                </div>
+
                                <p></p>
+
                            </li>
+
                        </ul>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div class="blog-post-item" id="MiniprepDigestion_id">
 
                     <div class="blog-post-item" id="MiniprepDigestion_id">
 
                         <h3>Miniprep Digestion</h3>
 
                         <h3>Miniprep Digestion</h3>
                         <p></p>
+
                         <p>One or more restriction enzymes are used to digest
                        <ul>
+
                        the DNA, resulting in either non-directional or
                            <li>One or more restriction enzymes are used to
+
                        directional insertion into the compatible plasmid. DNA
                            digest the DNA, resulting in either non-directional
+
                        was obtained after doing athe Miniprep (Plasmid DNA
                            or directional insertion into the compatible
+
                        Mini Kit I Spin Protocol). For carrying out the
                            plasmid. DNA was obtained after doing athe Miniprep
+
                        digestion to check if desired fragment is inside the
                            (Plasmid DNA Mini Kit I Spin Protocol). For
+
                        plasmid it is necessary to mix up the followingnext
                            carrying out the digestion to check if desired
+
                        components in a 200 ul Eppendorf.<br></p>
                            fragment is inside the plasmid it is necessary to
+
                        <div class="table-responsive" style=
                            mix up the followingnext components in a 200 ul
+
                        "width:55%;overflow:inherit">
                            Eppendorf.</li>
+
                            <table class="table table-bordered table-striped">
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
                                <tr>
                                <div class="table-responsive" style=
+
                                    <th>Reagent</th>
                                "width:55%;overflow:inherit">
+
                                    <th>Volume (μL)</th>
                                    <table class=
+
                                </tr>
                                    "table table-bordered table-striped">
+
                                <tr>
                                        <tr>
+
                                    <td>DNA</td>
                                            <th>
+
                                    <td>3</td>
                                                <ul>
+
                                </tr>
                                                    <li>Reagent</li>
+
                                <tr>
                                                </ul>
+
                                    <td>Specific buffer</td>
                                            </th>
+
                                    <td>1</td>
                                            <th>Volume (μL)</th>
+
                                </tr>
                                        </tr>
+
                                <tr>
                                        <tr>
+
                                    <td>Specific enzyme</td>
                                            <td>
+
                                    <td>1</td>
                                                <ul>
+
                                </tr>
                                                    <li>DNA</li>
+
                                <tr>
                                                </ul>
+
                                    <td>H<sub>2</sub>O milli-Q</td>
                                            </td>
+
                                    <td>5</td>
                                            <td>3</td>
+
                                </tr>
                                        </tr>
+
                            </table>
                                        <tr>
+
                        </div>
                                            <td>
+
                        <p>These are the specific enzymes and buffers for each
                                                <ul>
+
                        type of plasmid. The desired insert size for the clone
                                                    <li>Specific buffer</li>
+
                        library determines which enzymes are selected, as well
                                                </ul>
+
                        as the digestion conditions. Generally, once the mix is
                                            </td>
+
                        done, it is necessary to incubate it at 37°C at least 1
                                            <td>1</td>
+
                        hour.<br></p>
                                        </tr>
+
                        <div class="table-responsive" style=
                                        <tr>
+
                        "width:55%;overflow:inherit">
                                            <td>
+
                            <table class="table table-bordered table-striped">
                                                <ul>
+
                                <tr>
                                                    <li>Specific enzyme</li>
+
                                    <th>Plasmid</th>
                                                </ul>
+
                                    <th>Enzyme</th>
                                            </td>
+
                                    <th>Buffer</th>
                                            <td>1</td>
+
                                </tr>
                                        </tr>
+
                                <tr>
                                        <tr>
+
                                    <td>pUPD2</td>
                                            <td>
+
                                    <td>Not I</td>
                                                <ul>
+
                                    <td>Orange</td>
                                                    <li>H<sub>2</sub>O
+
                                </tr>
                                                    milli-Q</li>
+
                                <tr>
                                                </ul>
+
                                    <td>α</td>
                                            </td>
+
                                    <td>EcoRI</td>
                                            <td>5</td>
+
                                    <td>Specific</td>
                                        </tr>
+
                                </tr>
                                    </table>
+
                                <tr>
                                </div>
+
                                    <td>Ω</td>
                                <p></p>
+
                                    <td>BamHI</td>
                            </li>
+
                                    <td>Specific</td>
                            <li>These are the specific enzymes and buffers for
+
                                </tr>
                            each type of plasmid. The desired insert size for
+
                            </table>
                            the clone library determines which enzymes are
+
                        </div>
                            selected, as well as the digestion conditions.
+
                        <p><br></p>
                            Generally, once the mix is done, it is necessary to
+
                            incubate it at 37°C at least 1 hour.</li>
+
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
                                <div class="table-responsive" style=
+
                                "width:55%;overflow:inherit">
+
                                    <table class=
+
                                    "table table-bordered table-striped">
+
                                        <tr>
+
                                            <th>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>Plasmid</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </th>
+
                                            <th>Enzyme</th>
+
                                            <th>Buffer</th>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>pUPD2</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>Not I</td>
+
                                            <td>Orange</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>EcoRI</td>
+
                                            <td>Specific</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>BamHI</td>
+
                                            <td>Specific</td>
+
                                        </tr>
+
                                    </table>
+
                                </div>
+
                                <p></p>
+
                            </li>
+
                            <li></li>
+
                        </ul>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div class="blog-post-item" id=
 
                     <div class="blog-post-item" id=
 
                     "Agarosegelelectrophoresis_id">
 
                     "Agarosegelelectrophoresis_id">
 
                         <h3>Agarose gel electrophoresis</h3>
 
                         <h3>Agarose gel electrophoresis</h3>
                         <p></p>
+
                         <p><br></p>
                         <ul>
+
                         <ol>
                             <li></li>
+
                             <li>Prepare Agarose gel</li>
                            <li>1. Prepare Agarose gel</li>
+
                             Agarose gel is used in a concentration of 1% to
                             <li>Agarose gel is used in a concentration of 1% to
+
 
                             separate medium size fragments. The gel is made
 
                             separate medium size fragments. The gel is made
 
                             with agarose powder, TAE buffer 1X and ethidium
 
                             with agarose powder, TAE buffer 1X and ethidium
Line 969: Line 790:
 
                             gel concentration will be 1%. The ethidium bromide
 
                             gel concentration will be 1%. The ethidium bromide
 
                             concentration is 1:1000 in TAE Buffer (In the
 
                             concentration is 1:1000 in TAE Buffer (In the
                             previous example, 1 μL is needed).</li>
+
                             previous example, 1 μL is needed).
                             <li>Small gels where 10 samples can run need:</li>
+
                             Small gels where 10 samples can run need:
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
 
                                 <div class="table-responsive" style=
 
                                 <div class="table-responsive" style=
 
                                 "width:55%;overflow:inherit">
 
                                 "width:55%;overflow:inherit">
Line 978: Line 798:
 
                                         <tr>
 
                                         <tr>
 
                                             <th>
 
                                             <th>
                                                <ul>
+
                                            Reagent
                                                    <li>Reagent</li>
+
                                                </ul>
+
 
                                             </th>
 
                                             </th>
 
                                             <th>Amount</th>
 
                                             <th>Amount</th>
Line 986: Line 804:
 
                                         <tr>
 
                                         <tr>
 
                                             <td>
 
                                             <td>
                                                <ul>
+
                                            Agarose powder
                                                    <li>Agarose powder</li>
+
                                                </ul>
+
 
                                             </td>
 
                                             </td>
 
                                             <td>0.45 g</td>
 
                                             <td>0.45 g</td>
Line 994: Line 810:
 
                                         <tr>
 
                                         <tr>
 
                                             <td>
 
                                             <td>
                                                <ul>
+
                                            TAE 1X
                                                    <li>TAE 1X</li>
+
                                                </ul>
+
 
                                             </td>
 
                                             </td>
 
                                             <td>45 mL</td>
 
                                             <td>45 mL</td>
Line 1,002: Line 816:
 
                                         <tr>
 
                                         <tr>
 
                                             <td>
 
                                             <td>
                                                <ul>
+
                                            Ethidium bromide
                                                    <li>Ethidium bromide</li>
+
                                                </ul>
+
 
                                             </td>
 
                                             </td>
 
                                             <td>0.45 μL</td>
 
                                             <td>0.45 μL</td>
Line 1,011: Line 823:
 
                                 </div>
 
                                 </div>
 
                                 <p></p>
 
                                 <p></p>
                            </li>
+
                                <ol>
                            <li>1.1.Weight 0.45 g of agarose in a scale
+
                                    <li>Weight 0.45 g of agarose in a scale
                            precision.</li>
+
                                    precision.</li>
                            <li>1.2.Measure 45mL of TAE 1X. Add both of them
+
                                    <li>Measure 45mL of TAE 1X. Add both of
                            into an Erlenmeyer flask.</li>
+
                                    them into an Erlenmeyer flask.</li>
                            <li>1.3.Put it in a microwave for 1-3 min (until
+
                                    <li>Put it in a microwave for 1-3 min
                            agarose is dissolved)</li>
+
                                    (until agarose is dissolved)</li>
                            <li>1.4.Let agarose cool down.</li>
+
                                    <li>Let agarose cool down.</li>
                            <li>1.5.Add 0.45 μL of Ethidium bromide. This step
+
                                    <li>Add 0.45 μL of Ethidium bromide. This
                            is optional and allows the visualization of the DNA
+
                                    step is optional and allows the
                            under UV light.</li>
+
                                    visualization of the DNA under UV
                            <li>1.6.Collocating agarose solution in the correct
+
                                    light.</li>
                            tray. Do not forget putting the electrophoresis
+
                                    <li>Collocating agarose solution in the
                            comb. Pour slowly to avoid bubbles due to they
+
                                    correct tray. Do not forget putting the
                            could damage the gel.</li>
+
                                    electrophoresis comb. Pour slowly to avoid
                            <li>1.7.Let it at room temperature for 20-30
+
                                    bubbles due to they could damage the
                            minutes.</li>
+
                                    gel.</li>
                             <li>2.Running Agarose Gel:</li>
+
                                    <li>Let it at room temperature for 20-30
                            <li>2.1.When agarose gel is solidified, put it into
+
                                    minutes.</li>
                            electrophoresis unit. It has to be covered by 1X
+
                                </ol>
                            TAE buffer.</li>
+
                             <li>Running Agarose Gel:</li>
                            <li>2.2.Load the molecular weight ladder. It allows
+
                            to check if our fragment belongs to a specific band
+
                            checking the size that it has.</li>
+
                            <li>2.3.Load samples into the remaining wells. It
+
                            is recommendable to put 5 μL of DNA sample with 1
+
                            μL of loading buffer.</li>
+
                            <li>2.4.Run the gel at 100V (Small gel) or 120V
+
                            (Big gel). The time varies depending on gel
+
                            concentration and voltage.</li>
+
                            <li>2.5.Visualize DNA fragments using a
+
                            transilluminator.</li>
+
 
                             <li style="list-style: none; display: inline">
 
                             <li style="list-style: none; display: inline">
                                 <div class="table-responsive" style=
+
                                 <ol>
                                "width:55%;overflow:inherit">
+
                                     <li>When agarose gel is solidified, put it
                                     <table class=
+
                                     into electrophoresis unit. It has to be
                                     "table table-bordered table-striped">
+
                                    covered by 1X TAE buffer.</li>
                                        <tr>
+
                                    <li>Load the molecular weight ladder. It
                                            <th>
+
                                    allows to check if our fragment belongs to
                                                <ul>
+
                                    a specific band checking the size that it
                                                    <li>Electrophoresis
+
                                    has.</li>
                                                    parameters</li>
+
                                    <li>Load samples into the remaining wells.
                                                </ul>
+
                                    It is recommendable to put 5 μL of DNA
                                            </th>
+
                                    sample with 1 μL of loading buffer.</li>
                                            <th>Electrophoresis parameters</th>
+
                                    <li>Run the gel at 100V (Small gel) or 120V
                                        </tr>
+
                                    (Big gel). The time varies depending on gel
                                        <tr>
+
                                    concentration and voltage.</li>
                                            <td>
+
                                    <li>Visualize DNA fragments using a
                                                <ul>
+
                                     transilluminator.</li>
                                                    <li>DNA fragment</li>
+
                                 </ol>
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>5 μL</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>Loading buffer</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>1 μL</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>Molecular marker
+
                                                    1Kb</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>5 μL</td>
+
                                        </tr>
+
                                        <tr>
+
                                            <td>
+
                                                <ul>
+
                                                    <li>Voltage</li>
+
                                                </ul>
+
                                            </td>
+
                                            <td>100V to 120V</td>
+
                                        </tr>
+
                                     </table>
+
                                 </div>
+
                                <p></p>
+
 
                             </li>
 
                             </li>
                             <li></li>
+
                        </ol>
                         </ul>
+
                        <p></p>
 +
                        <div class="table-responsive" style=
 +
                        "width:55%;overflow:inherit">
 +
                             <table class="table table-bordered table-striped">
 +
                                <tr>
 +
                                    <th>Electrophoresis parameters</th>
 +
                                    <th>Electrophoresis parameters</th>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>DNA fragment</td>
 +
                                    <td>5 μL</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Loading buffer</td>
 +
                                    <td>1 μL</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Molecular marker 1Kb</td>
 +
                                    <td>5 μL</td>
 +
                                </tr>
 +
                                <tr>
 +
                                    <td>Voltage</td>
 +
                                    <td>100V to 120V</td>
 +
                                </tr>
 +
                            </table>
 +
                         </div>
 +
                        <p><br></p>
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                     <div class="blog-post-item" id="Luciferaseassay_id">
 
                     <div class="blog-post-item" id="Luciferaseassay_id">
 
                         <h3>Luciferase assay</h3>
 
                         <h3>Luciferase assay</h3>
                         <p></p>
+
                         <p>This procedure is done with the PrΩ kit
                        <ul>
+
                        (Dual-Luciferase Reporter Assay System)<br>
                            <li>This procedure is done with the PrΩ; kit
+
                        <br>
                            (Dual-Luciferase Reporter Assay System)</li>
+
                        Using <i><i>Agrobacterium</i> tumefaciens</i> as a
                            <li>Using <i><i>Agrobacterium</i> tumefaciens</i>
+
                        vehicle to insert the desired devise, it is necessary
                            as a vehicle to insert the desired devise, it is
+
                        insert it into a leaf of N.benthamiana by a direct
                            necessary insert it into a leaf of N.benthamiana by
+
                        injection. This method is known as Agroinfiltration.
                            a direct injection. This method is known as
+
                        The next step is letting infiltrated leafs for two or
                            Agroinfiltration. The next step is letting
+
                        three days depending on how the experiment is
                            infiltrated leafs for two or three days depending
+
                        programmed.<br>
                            on how the experiment is programmed.</li>
+
                        <br>
                            <li>After two days post infiltration, users can get
+
                        After two days post infiltration, users can get leaf
                            leaf disks from N.benthamiana using a hole punch.
+
                        disks from N.benthamiana using a hole punch. It is
                            It is recommended to take the maximum
+
                        recommended to take the maximum agroinfiltrated area
                            agroinfiltrated area avoiding plant nerves. Leaf
+
                        avoiding plant nerves. Leaf discs are put in a specific
                            discs are put in a specific plate depending on the
+
                        plate depending on the light condition requirements.
                            light condition requirements. Different samples are
+
                        Different samples are taken during the next two days
                            taken during the next two days after discs were
+
                        after discs were made and immediately they are put in
                            made and immediately they are put in liquid
+
                        liquid nitrogen and stored at -80°C.<br>
                            nitrogen and stored at -80°C.</li>
+
                        <br>
                            <li>The steps to follow are:</li>
+
                        The steps to follow are:<br></p>
                            <li style="list-style: none; display: inline">
+
                        <ol>
                                <ul>
+
                            <li>The Passive lysis buffer 1x is prepared. Each
                                    <li>he Passive lysis buffer 1x is prepared.
+
                            disk of leaf needs 200ul. The passive lysis buffer
                                    Each disk of leaf needs 200ul. The passive
+
                            is stored at 5X so it must be diluted with
                                    lysis buffer is stored at 5X so it must be
+
                            distilled water. Place it on the ice besides the
                                    diluted with distilled water. Place it on
+
                            LUCII substrate and the STOP solution.</li>
                                    the ice besides the LUCII substrate and the
+
                            <li>Cut off two little leaf disks of approximately
                                    STOP solution.</li>
+
                            0.8cm and put it into an Eppendorf tube.
                                    <li>Cut off two little leaf disks of
+
                            Immediately, freeze it with liquid nitrogen to
                                    approximately 0.8cm and put it into an
+
                            avoid the deterioration of vegetal material.</li>
                                    Eppendorf tube. Immediately, freeze it with
+
                            <li>Grind the freeze sample using the metabolomics
                                    liquid nitrogen to avoid the deterioration
+
                            robot. Put the samples on ice.</li>
                                    of vegetal material.</li>
+
                            <li>Add 150ul of passive lysis buffer 1x to each
                                    <li>Grind the freeze sample using the
+
                            Eppendorf tube.</li>
                                    metabolomics robot. Put the samples on
+
                            <li>Vortex gently.</li>
                                    ice.</li>
+
                            <li>Centrifuge 13200rpm during 15 minutes at 4°C.
                                    <li>Add 150ul of passive lysis buffer 1x to
+
                            While switch on the luminometer.</li>
                                    each Eppendorf tube.</li>
+
                            <li>Dilute 2:3 the extracts on a new Eppendorf
                                    <li>Vortex gently.</li>
+
                            tube. Add 36ul of Passive lysis buffer 1x and 24ul
                                    <li>Centrifuge 13200rpm during 15 minutes
+
                            of sample.</li>
                                    at 4°C. While switch on the
+
                            <li>Take an optimal plate to use in the
                                    luminometer.</li>
+
                            luminometer. Fill luminometer wells with 40 ul of
                                    <li>Dilute 2:3 the extracts on a new
+
                            LUCII which is stored at -20°C.</li>
                                    Eppendorf tube. Add 36ul of Passive lysis
+
                            <li>10 ul of sample is added in each well. Wait
                                    buffer 1x and 24ul of sample.</li>
+
                            10minutes. During this time turn on and configure
                                    <li>Take an optimal plate to use in the
+
                            the luminometer.</li>
                                    luminometer. Fill luminometer wells with 40
+
                            <li>Measure luciferase activity</li>
                                    ul of LUCII which is stored at -20°C.</li>
+
                            <li>Prepare 40 ul/well of Dual Glo 1x (STOP
                                    <li>10 ul of sample is added in each well.
+
                            solution + substrate). The substrate is at 50x
                                    Wait 10minutes. During this time turn on
+
                            concentration and stored at -20°C.</li>
                                    and configure the luminometer.</li>
+
                            <li>When the first luciferase measure is done, it
                                    <li>Measure luciferase activity</li>
+
                            is necessary to add 40 ul of Dual Glo into each
                                    <li>Prepare 40 ul/well of Dual Glo 1x (STOP
+
                            well. Let it rest during 10 minutes.</li>
                                    solution + substrate). The substrate is at
+
                            <li>Measure the Renilla activity.</li>
                                    50x concentration and stored at -20°C.</li>
+
                            <li>Take the obtained information and analyze
                                    <li>When the first luciferase measure is
+
                            it.</li>
                                    done, it is necessary to add 40 ul of Dual
+
                        </ol>
                                    Glo into each well. Let it rest during 10
+
                        <p>It must be kept in mind that the luminometer
                                    minutes.</li>
+
                        (machine to measure the luminescence) has to be ready
                                    <li>Measure the Renilla activity.</li>
+
                        before adding the reagents to the samples because it
                                    <li>Take the obtained information and
+
                        needs 10min to be ready. Set the timer (10min) with the
                                    analyze it.</li>
+
                        first sample of luciferase and add the reactant to the
                                </ul>
+
                        other samples as quick as possible.<br></p>
                            </li>
+
                            <li>It must be kept in mind that the luminometer
+
                            (machine to measure the luminescence) has to be
+
                            ready before adding the reagents to the samples
+
                            because it needs 10min to be ready. Set the timer
+
                            (10min) with the first sample of luciferase and add
+
                            the reactant to the other samples as quick as
+
                            possible.</li>
+
                        </ul>
+
 
                     </div>
 
                     </div>
 
                 </div>
 
                 </div>
Line 1,177: Line 963:
 
         </div>
 
         </div>
 
     </section>
 
     </section>
 
 
</body>
 
</body>
 
</html>
 
</html>
  
 
{{:Team:Valencia_UPV/Templates:footerUPV}}
 
{{:Team:Valencia_UPV/Templates:footerUPV}}

Revision as of 22:12, 1 October 2016

Protocols

Orange DNA Genome Extraction Protocol (Adapted from Delaporta extraction protocol)

DNA EB Extraction Buffer DNA EB Extraction Buffer
100mM Tris pH 8 50ml of Tris HCl 1M
50mM EDTA pH 8 50 ml of EDTA 0.5M pH8
500 mM NaCl 14.63 g NaCl
Raise to 0.5 L Raise to 0.5L

When it is going to be used, add b-mercaptoethanol to 10mM (10μL).


First phase

  1. Weight 1g of tissue, freeze and grind with liquid nitrogen. Turn on water bath to 65°C
  2. Add 15mL of extraction buffer (remember to add mercaptoethanol, 10μL) in a beckman tube.
  3. Add 1mL of SDS 20%, shake vigorously and incubate 10 minutes at 65°C. Shake time to time.
  4. Add 5mL of K-Ac 5M, shake vigorously and incubate 0°C during 20 minutes.
  5. Centrifuge, JA20, 14krmp, 20 minutes.
  6. Filter the supernatant through a nylon fabric of 30u and pass to clean beckman tubes.
  7. Add 10mL of isopropanol, mix and incubate at -20°C during minimum 20 minutes. They can be left overnight.
  8. Centrifuge, JA20, 10krmp, 15 minutes.
  9. Pour and dry partially with the tubes inverted on blotting paper during 10 minutes. Warning: occasionally, the pellet may slide, so it is convenient to control the dry process.
  10. Resuspend the pellet in 0.7mL of TE (Tris HCl 50mM + EDTA 10mM). Put on Eppendorf tubes. Centrifuge 10 minutes at 7000rmp.
  11. Transfer the supernatant to other Eppendorf. Add 75μL of Na-Ac 3M (approximately 1/10 of the volume) and 0.5mL of isopropanol (around 60% of volume). Mix well and centrifuge 2-3 minutes at 10000rpm. If no pellet is produced, it will be a DNA concentration in the bottom; in this case, the supernatant should be removed with a pipette being extremely careful to not lose the DNA.
  12. Wash the sediment once or twice with 70% ethanol (200-100 μL and centrifuge). Dry on speed-vac and resuspend in 0.1mL of mili-Q water. If with this amount of water it is not well dissolved, add more water each time. To dissolve it is left on ice, shaking from time to time, during approximately one hour.

Second phase

  1. Add RNAase A up to 100 ug/L (add V/99 of the stock solution at 10mg/mL), digest at 37°C at least during 20 minutes.
  2. Add 1 volume of phenol and invert during 1 minute.
  3. Add 1 volume of chloroform. Centrifuge 5 minutes.
  4. Transfer upper aqueous phase to other Eppendorf. Add NaCl 5M until 0.2M (V x 0.0416 of NaCl 5M)
  5. Centrifuge 15 minutes. If centrifuged is not clear, add 100 ug of ethanol and then, centrifuge 15 minutes.
  6. Wash with ethanol 70%. Dry with speed-vac and dissolve in 0.1 ml of H2O milli-Q.


Rice DNA Genome Extraction Protocol

  1. Prepare buffers, cool centrifuge at 4°C and heat up thermoblock at 50°C and 37°C.
  2. Put around 0.2 gr of vegetal material in an Eppendorf.
  3. Add, previously mix a and b:
    1. 0.55 mL of Extraction Buffer (mash and put directly the buffer. Put it on ice. A pasty green will stay.
    2. 0.55 mL of phenol (tris-HCl) / chloroform / isoamyl (25/24/1)
  4. Vortex 20 seconds and put on ice.
  5. Centrifuge 5 minutes at maximum speed (4°C). Two phases will be formed.
  6. Transfer the supernatant (around 500 ug) to other Eppendorf.
  7. Add 0.55 mL of phenol (tris-HCl) / chloroform / isoamyl (25/24/1)
  8. Vortex 20 seconds and put on ice.
  9. Centrifuge 5 minutes at maximum speed (4°C). Two phases will be formed. Collect upper phase into a new Eppendorf.
  10. Add 0.1 volume of AcNa 3M and 2.5 volumes of EtOH absolute. Put it on ice and mash it manually.
  11. Centrifuge 10 minutes at maximum speed (4°C)
  12. Pour liquid and let dry between 30-60 minutes (cover opened)
  13. Add 200μL of TNE and 2 ug of RNAsa (10mg/mL stock)
  14. Incubate 10 minutes at 37°C
  15. Resuspend carefully pellet and spin to let fall liquid from walls.
  16. Add 200 ug of phenol (tris-HCl)/ chloroform/isoamyl (25/24/1). Slowly invert it.
  17. Centrifuge 5 minutes at maximum speed.
  18. Transfer the supernatant (around 200 ug) to other Eppendorf.
  19. Add 50-100ug of H2O milli-Q. Then, add 0.1 Volume of AcNa 3M + 2 Volume of EtOH 100%. Invert it.
  20. Let it:
    1. Overnight at -20°C
    2. 20 minutes at -80°C
  21. Centrifuge 30 minutes at maximum speed. Pour liquid and let pellet dries.
  22. Add 100ug of EtOH 70% and put it quickly on ice. Once they are all, shake it.
  23. Centrifuge 5 minutes at maximum speed.
  24. Pour liquid.
  25. Resuspend pellet in H2O milli-Q


Extraction Buffer Stock solution Volume for 500mL
0.2M Tris-HCl, ph=9.0 1M Tris-HCl, pH=9.0 100 mL
0.4LiCl 2M LiCl 100 mL
25mM EDTA 0.5M EDTA 25 mL
1% SDS 10% SDS 50 mL
H20 milli-Q 225 mL

TNE Buffer Stock solution Volume para 500mL
0.01M Tris-HCl, pH=8 1M Tris-HCl, pH=8 5 mL
0.1M NaCl 5M NaCl 10 mL
1mM EDTA, pH=8 0.5M EDTA 1 mL
H20 milli-Q 484 mL

TE Buffer
10mM Tris pH=8 1M Tris pH=8 0.5 mL
1mM EDTA 0.5M EDTA 0.1 mL
H20 milli-Q 49.4 mL

Phenol (Tris-HCl)/Chloroform/isoamyl 25/24/11
AcNA 3M
RNAsa
EtOH Absolute.

Agrobacterium infiltration

  1. Centrifuge 15 minutes at 3000 rpm the Agrobacterium culture.
  2. Prepare infiltration medium:
    1. 10 mL of MES 10X
    2. 1 mL of MgCl 100X
    3. Raise to 100 mL
    4. Weight 9.8 mg of Acetosyringone and resuspend it in 250 μL of DHSO. Add 100 μL to the 100mL previously made.
    5. Discard supernatant and resuspend in 5mL of Agroinfiltration medium.
    6. Vortex to mix correctly
    7. Cover falcons tubes with foil and incubate for 2 hours with stirring.
  3. MES 10X Volume Notes
    H2O milliQ 500mL Adjust to pH=5.6 with KOH. Sterilize
    MES 10.66 g Adjust to pH=5.6 with KOH. Sterilize
    Acetosyringone 20Mm(1000X) Adjust to pH=5.6 with KOH. Sterilize

    Volume Notes
    Acetosyringone 78.48 mg -
    DMSO 2mL -

    MgCl2 (100X) Volume Notes
    MgCl2 20.3 g Sterilize
    H2O Until 100mL Sterilize

  4. Measuring OD
    • C0 x V0 = C x V   V = 20 mL   C = 0.2 g/mol
    • V0 = (0.2 x 20)/(0.38 x 5)=2.11 mL of culture is necessary to obtain the required optical density.

E.coli Transformation

Electroporation method was used in order to transform a DNA construction. This procedure is commonly used for E. coli and Agrobacterium.
  1. The electroporation cuvette was put in ice 10 minutes before inserting the cells. An aliquot of electrocompetent cells are taken out of the -80°C freezer, and they are put immediately into ice.
  2. 1-2 ul of the ligation product are taken and added carefully to them.
  3. 60 ul of the mix are taken and put into an electroporation cuvette making sure that there are no bubbles.
  4. The cuvette is dried and put in the electroporator, making sure that any spark is done. In that case, the process does not work and must be repeated. This could happen when plasmid and E. coli concentration are not optimal.
  5. The voltage for the electroporator is 1500V for E. coli and 1440V for Agrobacterium.
  6. Transformed cells are resuspended in 300 μL of LB in the electroporation cuvette. Then, they are taken and put into an Eppendorf letting them grow in the shaker for 2 hours at 37°C.

Minipreps

In order to carry out all of necessary Miniprep -extraction of the plasmids out of E. coli -the protocol of the Omega kit (Plasmid DNA Mini Kit I Spin Protocol) is used. The steps to do it are:

  1. Grow 1-5 mL culture overnight in a 10-20 mL culture tube.
  2. Centrifuge at 10.000 x g for 1minute at room temperature. Decant or aspirate and discard the culture media.
  3. Add 250 ul Solution I mixed with RNase A. Vortex or pipet up and down to mix thoroughly. Transfer suspension into a new 1.5mL microcentrifuge tube.
  4. Add 250 ul Solutions II. Invert and gently rotate the tube several times to obtain a clear lysate. A 2-3 minute incubation may be necessary. Avoid vigorous mixing and do not exceed a 5 minute incubation.
  5. Add 350 ul Solution III. Immediately invert several times until a flocculent white precipitate forms. Centrifuge at maximum speed (>13.000xg) for 10 minutes. A compact white pellet will form. Promptly proceed to the next step.
  6. Insert a HiBind DNA Mini Column into a 2 mL Collection tube.
  7. Transfer the cleared supernatant from Step 6 CAREFULLY aspirating it into the HiBind DNA Mini Column. Centrifuge at maximum speed for 1 minute. Discard the filtrate and reuse the collection tube.
  8. Add 500 ul HBC Buffer diluted with isopropanol
  9. Centrifuge at maximum speed for 1 minute. Discard the filtrate and reuse collection tube.
  10. Add 700 ul DNA Wash Buffer diluted with ethanol. Centrifuge at maximum speed for 1 minute. Discard the filtrate and reuse the collection tube.
  11. Centrifuge the empty HiBind DNA Mini Column at maximum speed for 2 minutes to dry the column. This step is critical for removal of trace ethanol that may interfere with downstream applications.
  12. Transfer the HiBind DNA Mini Column into a nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tube.
  13. Add 50 ul Elution Buffer or sterile deionized water directly to the center of the column membrane.Let sit at room temperature for 1 minute. Centrifuge at maximum speed for 1 minute.
  14. Store eluted DNA at -20°C.


Petri dish culture

Bacteria are transformed with a plasmid which gives them resistance to a specific antibiotic. Petri dishes must include this antibiotic to reject those bacteria that have not acquired the plasmid.

  • E. coli- pUPD2 plasmids: chloramphenicol.
  • E. coli- Alpha 1 and 2: kanamycin.
  • E. coli- Omega 1 and 2: streptomycin
  • Agrobacterium: rifampicin + the specific one for each construction.

To carry out this procedure is necessary to work in the laminar flux cabinet.
This procedure is necessary to made it in the laminar flux cabinet. After E. coli transformation, cells are put into an Eppendorf letting them grow at 37°C. The spread plate method is done with 50-40 ul of this bacteria culture. To plate it is used aIt is used for plating a glass dipstick. After that, E. coli culture plates are put at 37°C for approximately 16h. Agrobacterium growth needs 32h at 28°C.

Ligation reaction

The assembly of DNA fragments, commonly referred to as Golden Gate assembly, is an efficient technique where multiple inserts could be assembled into a vector backbone. The net result is the ordered and seamless assembly of DNA fragments in only one reaction. The ligations have a total volume of 10 μL so all of sequences that form part of the constructions are mixed up in an Eppendorf of 0.2mL.
This mix is put in a thermocycler with the programs GB (Golden Braid) or GG (Golden Gate).

Reagent Volume (μL)
DNA fragments 1 of each part of the assembly
Plasmid (pUPD2 - α1 - α2) 1
BSA 10X 1.2
Ligase Buffer 1.2
Bsmb I 1
T4 ligase 1
H2O milli-Q Raise until final volume (10 μL)

DNA1 in pUPD2 + DNA2 in pUPD2 = DNA1 + DNA2 in α DNA1 in α1 + DNA2 in α2 = DNA1 + DNA2 in Ω
1 μL DNA1 in pUPD2 1 μL DNA1 in α1
1 μL DNA2 in pUPD2 1 μL DNA2 in α2
1 μL of α plasmid 1 μL of Ω plasmid
1.2 μL buffer ligase 1.2 μL buffer ligase
1.2 μL BSA10X 1.2 μL BSA10X
1 μL T4 ligase 1 μL T4 ligase
1 μL Bsmb I 1 μL Bsa I
4.6 μL H2O milli-Q 4.6 μL H2O milli-Q

Miniprep Digestion

One or more restriction enzymes are used to digest the DNA, resulting in either non-directional or directional insertion into the compatible plasmid. DNA was obtained after doing athe Miniprep (Plasmid DNA Mini Kit I Spin Protocol). For carrying out the digestion to check if desired fragment is inside the plasmid it is necessary to mix up the followingnext components in a 200 ul Eppendorf.

Reagent Volume (μL)
DNA 3
Specific buffer 1
Specific enzyme 1
H2O milli-Q 5

These are the specific enzymes and buffers for each type of plasmid. The desired insert size for the clone library determines which enzymes are selected, as well as the digestion conditions. Generally, once the mix is done, it is necessary to incubate it at 37°C at least 1 hour.

Plasmid Enzyme Buffer
pUPD2 Not I Orange
α EcoRI Specific
Ω BamHI Specific


Agarose gel electrophoresis


  1. Prepare Agarose gel
  2. Agarose gel is used in a concentration of 1% to separate medium size fragments. The gel is made with agarose powder, TAE buffer 1X and ethidium bromide. It is necessary to adjust the amount of agarose to get the desired gel concentration. For example, with 1g of agarose / 100 mL of TAE 1X, the gel concentration will be 1%. The ethidium bromide concentration is 1:1000 in TAE Buffer (In the previous example, 1 μL is needed). Small gels where 10 samples can run need:
    Reagent Amount
    Agarose powder 0.45 g
    TAE 1X 45 mL
    Ethidium bromide 0.45 μL

    1. Weight 0.45 g of agarose in a scale precision.
    2. Measure 45mL of TAE 1X. Add both of them into an Erlenmeyer flask.
    3. Put it in a microwave for 1-3 min (until agarose is dissolved)
    4. Let agarose cool down.
    5. Add 0.45 μL of Ethidium bromide. This step is optional and allows the visualization of the DNA under UV light.
    6. Collocating agarose solution in the correct tray. Do not forget putting the electrophoresis comb. Pour slowly to avoid bubbles due to they could damage the gel.
    7. Let it at room temperature for 20-30 minutes.
  3. Running Agarose Gel:
    1. When agarose gel is solidified, put it into electrophoresis unit. It has to be covered by 1X TAE buffer.
    2. Load the molecular weight ladder. It allows to check if our fragment belongs to a specific band checking the size that it has.
    3. Load samples into the remaining wells. It is recommendable to put 5 μL of DNA sample with 1 μL of loading buffer.
    4. Run the gel at 100V (Small gel) or 120V (Big gel). The time varies depending on gel concentration and voltage.
    5. Visualize DNA fragments using a transilluminator.

Electrophoresis parameters Electrophoresis parameters
DNA fragment 5 μL
Loading buffer 1 μL
Molecular marker 1Kb 5 μL
Voltage 100V to 120V


Luciferase assay

This procedure is done with the PrΩ kit (Dual-Luciferase Reporter Assay System)

Using Agrobacterium tumefaciens as a vehicle to insert the desired devise, it is necessary insert it into a leaf of N.benthamiana by a direct injection. This method is known as Agroinfiltration. The next step is letting infiltrated leafs for two or three days depending on how the experiment is programmed.

After two days post infiltration, users can get leaf disks from N.benthamiana using a hole punch. It is recommended to take the maximum agroinfiltrated area avoiding plant nerves. Leaf discs are put in a specific plate depending on the light condition requirements. Different samples are taken during the next two days after discs were made and immediately they are put in liquid nitrogen and stored at -80°C.

The steps to follow are:

  1. The Passive lysis buffer 1x is prepared. Each disk of leaf needs 200ul. The passive lysis buffer is stored at 5X so it must be diluted with distilled water. Place it on the ice besides the LUCII substrate and the STOP solution.
  2. Cut off two little leaf disks of approximately 0.8cm and put it into an Eppendorf tube. Immediately, freeze it with liquid nitrogen to avoid the deterioration of vegetal material.
  3. Grind the freeze sample using the metabolomics robot. Put the samples on ice.
  4. Add 150ul of passive lysis buffer 1x to each Eppendorf tube.
  5. Vortex gently.
  6. Centrifuge 13200rpm during 15 minutes at 4°C. While switch on the luminometer.
  7. Dilute 2:3 the extracts on a new Eppendorf tube. Add 36ul of Passive lysis buffer 1x and 24ul of sample.
  8. Take an optimal plate to use in the luminometer. Fill luminometer wells with 40 ul of LUCII which is stored at -20°C.
  9. 10 ul of sample is added in each well. Wait 10minutes. During this time turn on and configure the luminometer.
  10. Measure luciferase activity
  11. Prepare 40 ul/well of Dual Glo 1x (STOP solution + substrate). The substrate is at 50x concentration and stored at -20°C.
  12. When the first luciferase measure is done, it is necessary to add 40 ul of Dual Glo into each well. Let it rest during 10 minutes.
  13. Measure the Renilla activity.
  14. Take the obtained information and analyze it.

It must be kept in mind that the luminometer (machine to measure the luminescence) has to be ready before adding the reagents to the samples because it needs 10min to be ready. Set the timer (10min) with the first sample of luciferase and add the reactant to the other samples as quick as possible.

Sponsors